*, Andrea del Pilar Quintero



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Materiales y método

Aislamiento, identificación y mantenimiento de los microorganismos

Las muestras fueron recolectadas de diferentes puntos al azar, tomando 500 g a una profundidad no mayor de 15 cm de lodos aceitosos provenientes de lavaderos de carros, lodos de sistemas de alcantarillado de zonas industriales de la ciudad de Bucaramanga, y lodos estabilizados del tratamiento de aguas residuales domésticas, los cuales se depositaron en bolsas plásticas selladas, conservadas en refrigeración hasta su procesamiento, y transportadas a los laboratorios de la Planta de tratamiento de aguas residuales (PTAR) Río Frío (Girón).

Para el aislamiento se someten las muestras a un pre-enriquecimiento adicionando 100 g de cada una de estas en 250 ml del medio caldo básico de sales (CBS) modificado –NaCl 0,15 g (NH4)2SO4 0,3 g, KH2PO4 0,37 g, KH2PO4 0,125 g, 0,125 g, MgSO4.7H2O 0,075 g, KNO3 0,3 g) (Narváez et al., 2008), a temperatura ambiente, en agitación constante a una velocidad de 140 rpm, durante un periodo de doce días.

A partir del sexto día, hasta el día doce, se tomó un inóculo y sembró por agotamiento en placas de Agar MacConkey (AMck), Agar Nutritivo (AN), Agar Cetrimide, Agar Sangre (AS) y Agar Infusión de Suelo 25% (se obtuvo a partir de 500 g de lodo contaminado en 100 ml de agua destilada, se agitó y dejó en reposo 24 horas, posteriormente se filtró y con el filtrado se trabajó al 25%, y se adicionó agar-agar csp); después se incubó a 32 ºC por 24-48 horas en Agar Sangre (AS) a 32 ºC por 24-48 horas en atmósfera de 3-6% de CO2, y en Agar Saboraud a temperatura ambiente durante 5 días para aislamiento de hongos.

La identificación de los hongos aislados se realizó basándose en las características morfológicas de las colonias (color, aspecto, consistencia, observación del anverso y reverso de la colonia, y presencia o ausencia de pigmentos y exudados) y la observación microscópica de estructuras características de los géneros empleados en este estudio (presencia o no de septos, pigmentación o no las hifas y observación de estructuras de reproducción asexual). La identificación de bacterias se realizó a partir de la serie bioquímica (triple azúcar hierro agar, citrato, SIM, úrea, malonato, motilidad, fenilalanina, rojo de metilo, Voges Proskauer, lisina hierro agar) y sistema semiautomatizado (BBL CRYSTAL-NF y gram positivos según el caso) y pruebas adicionales (citocromooxidasa, catalasa, Indol, de oxidación-fermentación OF: glucosa, sacarosa, lactosa, manitol, maltosa). Posterior a la identificación se realizaron repiques en medio modificado (con aceite lubricante usado al 10%) y se sembraron en medio simple con glicerol para su conservación (refrigeración 4 °C y congelación -20 ºC).


Preparación del inóculo

Posterior a la identificación de los microorganismos se realizaron pruebas de degradabilidad y compatibilidad. Para la prueba de degradabilidad (cualitativa) se empleó un medio de cultivo líquido modificado a diferentes concentraciones de aceites quemados (10, 15, 25 y 50%) para verificar la remoción de hidrocarburos, controlando visualmente cada cuatro horas la presencia o disminución de la capa de aceite en la superficie del medio debida al consumo de las grasas por parte de los microorganismos con la formación de micelas (comunicación personal Nieto L. ICP, 2005).

Las pruebas de competitividad o compatibilidad se realizaron en agar modificado confrontando todos los microorganismos en siembra masiva hasta la mitad de la caja con una cepa A e incubada a 37 ºC por 24 horas; posterior a este tiempo, en la mitad no sembrada se realizó la siembra mediante una estría perpendicular con otra cepa B, que fue incubada nuevamente durante 24 horas a 37 ºC; de acuerdo con estos resultados se determinaron los microorganismos compatibles (Garzón et al., 2001).

El medio utilizado para la aplicación del pool bacteriano a cada biopila se preparó a partir de 2 litros de agua, melaza al 5%, sales minerales 0,1%, extracto de levadura 0,5%, con una concentración bacteriana de 3x108 ufc/ml comparada con la escala de MacFarland, confirmada por la técnica de recuento por vertido en placa tomando un volumen de 1 ml de una dilución (de 101 hasta 108) en una caja de Petri estéril, a la cual se le adicionó medio de cultivo fundido (Plate Count), previamente enfriado a una temperatura de 40 ºC, mezclado e incubado de 35-37 ºC por 24 horas; la inoculación de los hongos (Aspergillus spp, Trichoderma spp, Fusarium spp) se realizó los días 15-45-60-75, la concentración óptima fue de 1x 106 esporas/ml el cual se obtuvo al inocular los microorganismos fúngicos en medio líquido (Caldo Malta), incubados a temperatura ambiente por cinco días.



Construcción de biopilas

En el primer ensayo se trabajó con cinco biopilas para las pruebas de campo figura 1. En el segundo ensayo se trabajaron ocho biopilas, en la figura 2 se observa cada biopila construida con una inclinación de 15°, un área de 1 m2 con un peso de 50 kg y polisombra para la protección contra los rayos solares; adicionalmente se dispuso un tubo en el centro con agujeros para facilitar la recolección de lixiviados. La tabla 1 muestra el primer grupo conformado por cinco biopilas, el tratamiento de éstas se planteó para 40 días, cada una de ellas conformada por una mezcla de lodo deshidratado proveniente de tratamiento de aguas residuales domésticas y lodo proveniente de lavaderos de carros. Las inoculaciones de los pool bacterianos se realizaron los días 1-10-20 y 30, con los siguientes microorganismos:





Figura 1. Montaje de las pruebas de campo del ensayo con cinco biopilas lodo lavadero de carros y lodo deshidratado. Fuente: las autoras.

Tabla 1. Conformación de cada biopila del tratamiento 1. Proporción de 4:1 de lodo contaminado/lodo deshidratado. Concentración inicial en cada biopila 21.274,5 ppm de TPH

Biopila

Microorganismos

No. 1

Testigo

No. 2

Acinetobacter spp (I )

Bacillus spp ( A)

Micrococcus spp (M)

Aspergillus níger ( G, )

No. 3

Citrobacter spp ( E)

Acinetobacter spp ( I )

Nocardia spp ( CK)

Trichoderma spp (H))

No. 4

Acinetobacter spp ( I )

Pseudomonas aureuginosa (S1, Pseudomonas spp (S2)

Trichoderma spp (H)

No. 5

Pseudomonas aureuginosa (S1) Pseudomonas spp (S2)

Citrobacter spp ( E)

Trichoderma spp ( H)

Fuente: las autoras.
El segundo grupo estuvo conformado por 8 biopilas constituidas por lodo deshidratado (proveniente de tratamiento primario de aguas residuales domésticas) usadas como aporte de materia orgánica y lodo contaminado con aceites lubricantes usados provenientes del sistema de alcantarillado de la zona industrial.

Figura 2. Disposición de las 8 biopilas para el trabajo de campo. Fuente: las autoras.


Tabla 2. Grupo de 8 biopilas, se aplicó bioaumentación los días 1-30-60-90. Tiempo total 120 días

Biopila

Microorganismo - código

Relación lodos

TPH ppm

No. 1

Acinetobacter spp (I)

Micrococcus spp ( M)

E. coli ( C)

Bacillus spp (CU)

Rhizopus spp ( D)



1:4 una parte lodo alcantarillado zona industrial-4 partes lodo deshidratado PTAR

20.600

No. 2

Acinetobacter spp (I)

Citrobacter spp (CT)

Nocardia spp (CK)

Rhizopus spp ( D)

1:4 una parte lodo alcantarillado industrial-4 partes lodo deshidratado PTAR

20.600

No. 3

Pseudomona aureuginosa (S1) Pseudomonas putida (S2)

Aspergillus spp (F)

Trichoderma spp (H) )

1:4 una parte lodo alcantarillado zona industrial-4 partes lodo deshidratado PTAR

20.600

No. 4

Acinetobacter spp ( I)

Bacillus spp ( CU)

Micrococcus spp (M)

Pseudomonas putida (S2)

Trichoderma spp ( H)

1:4 una parte lodo alcantarillado zona industrial-4 partes lodo deshidratado PTAR

20.600

No. 5

Pseudomonas aureuginosa (S1)

E. coli ( C)

Nocardia spp (CK)

Trichoderma spp) (H)

1:1 partes de lodo alcantarillado zona industrial y lodo deshidratado de la PTAR

30.150

No. 6

Pseudomonas putida (S2)

Acinetobacter spp ( I )



Micrococcus spp ( M )

Trichoderma spp ( H)

1:1 partes de lodo alcantarillado zona industrial y lodo deshidratado de la PTAR

30.150

No. 7

Pseudomonas aureuginosa ( S1)

Bacillus spp (CU)

Micrococcus spp (M )

Rhizopus spp) ( D)

4:1 partes de lodo de zona industrial y una parte de lodo deshidratado PTAR

39.660

No. 8

Acinetobacter spp ( I )

Pseudomonas putida ( S2)

Nocardia spp (CK)

Trichoderma spp (H)

4:1 partes de lodo de zona industrial y una parte de lodo deshidratado PTAR

39.660

Fuente: las autoras.

A los dos grupos se les monitorearon parámetros como temperatura y humedad diariamente por la prueba del puño y en laboratorio por técnica gravimétrica cada ocho días, para mantener un nivel cercano entre 60-70%, en caso necesario se adicionó agua corriente, pH cada 10 días con el uso del potenciómetro, recuento de microorganismos viables antes y 72 horas posteriores a la adición de los inóculos bacterianos, adición de nutrientes NPK (15-15-15 ) 100 g disueltos en agua en los días 8-16-24 del montaje y aireación (por volteos manuales) durante la aplicación de los microorganismos.



Análisis físico-químico

Las determinaciones de TPH se realizaron por extracción soxhlet por 72 horas, concentración y determinación por gravimetría (5520 D), determinación de grasas y aceites por extracción soxhlet (ISO/TR 11046) y plomo por absorción atómica, pre, durante y postratamiento, en los laboratorios certificados (Laboratorio de Consultas Industriales de la Universidad Industrial de Santander, Laboratorio de Química de la Universidad de Santander, Laboratorio de Control de Calidad del Acueducto Metropolitano de Bucaramanga y Laboratorio de la PTAR- Río Frío).



Análisis estadístico

En los dos ensayos se analizó la variable continua TPH en ppm mediante el método de modelos mixtos lineales en bloques aleatorios completos (Littell et al., 2006) donde el efecto de bloque es dado por el tiempo y se considera un efecto aleatorio, y el factor experimental por evaluar es el tipo de tratamiento y se considera un efecto fijo. En el primer ensayo se realizaron contrastes seleccionados entre la biopila 1 y las biopilas 2, 3, 4 y 5 (Littell et al., 2006).



Resultados

Se aislaron 22 microorganismos de importancia en procesos de biorremediación en la fase 1 del proyecto dentro de los que se encuentran gram positivos, gram negativos y hongos (ver Anexo), los que posteriormente se utilizaron para la conformación de consorcios y la aplicación en las diferentes biopilas para llevar a cabo el proceso de descontaminación de los TPH presentes en los lodos contaminados.

La variación del pH y la temperatura a través del proceso se observan en la tabla 3.

Tabla 3. Lecturas promedio de pH y temperatura en cada una de las biopilas durante 30 días en el primer ensayo con 5 biopilas

Fecha

Biopila 1

Biopila 2

Biopila 3

Biopila 4

Biopila 5

pH

Temperatura

ºC


pH

Temperatura

ºC


pH

Temperatura

ºC


pH

Temperatura ºC

pH

Temperatura

ºC


Diciembre 26 /05


7,9

22

6,2

23

7,3

23

6,4

23

7,2

23

Enero 3 2006


8,0

24

6,9

23

7,3

23

6,5

23

7,3

23

Enero 10 2006

8,1

26

7,3

25

7,5

26

6,7

26

7,6

23

Enero 17 2006

8,2

26

7,1

25

7,3

26

6,7

26

7,5

24

Enero 26 2006


8,2

26

6,9

23

7,4

25

6,4

25

7,6

26

En el primer ensayo se evaluó el efecto de 5 diferentes tratamientos para la degradación de residuos contaminantes en lodos provenientes de lavaderos de carros en la respuesta determinada por la concentración de TPH en ppm, en un periodo experimental de 40 días con observaciones tomadas a los días 0, 15, 30 y 40. En la tabla 4 se observan las concentraciones iniciales y finales de TPH y los porcentajes de remoción de TPH en cada biopila.

Tabla 4. Porcentaje de remoción de TPH por el método de extracción Soxhlet en 72 horas, para determinar efecto de los microorganismos inoculados en cada una de las biopilas

Nº Biopila

Inóculos

Concentración inicial TPH (ppm)

Concentración final TPH (ppm))

% Remoción

Tiempo de Remoción (días)

1 (control negativo)

Sin inóculo

21.274,5

19.785,3

19.783,8

19.783,7


6,9

7,0


7,0

15

30

40



2

Bacterias: A, I, M

Hongo G


21.274,5

15.955,88 12.948,04

11.523,01



24,9

39,1


45,8

15

30

40



3

Bacterias: E, I, CK

Hongo: H


21.274,5

14.168,62 11.899,015

9.725,12



33,4

44,1


54,28

15

30

40



4

Bacterias:

S1, S2 ,I

Hongo: H


21.274,5

12.190,19

5.989,39

2.745,28


42

71,8


87,09

15

30

40



5

Bacterias: S1, S2, ,

Hongo: H


21.274,5

14.104,9

7.722,5


5.523,11

33,7

63,7


74,03

15

30

40



La concentración de plomo pretratamiento en el lodo contaminado fue 90 mg/l.

Los resultados obtenidos de la determinación de Pb a los 40 días postratamiento por el método de absorción atómica se reportan en la tabla 5.



Tabla 5. Resultados de plomo (Pb) Postratamiento. Método de absorción atómica

Biopila

Pb

mg/l

1

70

2

90

3

80

5

60

En la gráfica 1 se observa la variación de las concentraciones de TPH en ppm a través del tiempo en las 5 biopilas. Todas las biopilas partieron de la misma concentración de TPH, la biopila control presentó una disminución mínima de TPH mientras que las biopilas 2, 3, 4 y 5 presentaron una disminución aparentemente significativa en los 40 días del experimento.




Gráfica 1. Variación de las concentraciones de TPH en cuarenta días.

Para determinar la existencia de diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos se ajustó un modelo lineal mixto a los datos (tabla 6). La prueba de significancia del modelo presentada en la tabla 7 revela diferencias significativas entre los tratamientos. En la tabla 8 se observan los contrastes seleccionados comparando la biopila control con las biopilas 2, 3, 4 y 5. Los contrastes muestran evidencias de diferencias significativas al nivel de significancia 0,05 entre la biopila control y la biopila 2, y al nivel de significancia 0,01 entre la biopila control y las biopilas 3, 4 y 5.



Tabla 6. Estimados y errores estándar de los parámetros del modelo lineal mixto utilizado para el análisis de bloques aleatorios completos del ensayo en el cual se evaluó el efecto de 5 diferentes tratamientos para la degradación de lodos provenientes de lavaderos de carros, en la respuesta determinada por la concentración de TPH en ppm, en un periodo experimental de 40 días con observaciones tomadas a los días 0, 15, 30 y 40.

Efectos fijos

Parámetro

Estimado

Error Standard

p-valor

Intercepto

12156

2836,93

0,0234

Biopila 1

8000,57

2071,1

0,0023

Biopila 2

3269,11

2071,1

0,1404

Biopila 3

2110,56

2071,1

0,3283

0,453


Biopila 4

-1606,41

2071,1

Efectos aleatorios

Tiempo 0

6305,34

2665,17




Tiempo 15

680,51

2665,17




Tiempo 30

-2649,93

2665,17




Tiempo 40

-4335,93

2665,17





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