1. introduccióN 1 Sistema Inmune Innato y Adquirido



Descargar 206.7 Kb.
Página1/3
Fecha de conversión30.06.2017
Tamaño206.7 Kb.
  1   2   3
1. INTRODUCCIÓN

    1. 1.1 Sistema Inmune Innato y Adquirido

El sistema inmune comprende una red celular y molecular integrada, en la cual sus componentes orquestan respuestas complejas y rápidas frente a la invasión por microorganismos patógenos. El mecanismo de defensa inicial a esta agresión está dado por el sistema inmune innato, que responde coordinadamente mediante la expresión de ciertas proteínas receptoras y la secreción de moléculas solubles (1). La primera línea de defensa esta representada por macrófagos y células dendríticas como también por las barreras físicas, tales como la piel y las mucosas (2). Los microorganismos que logran atravesar estas barreras inducen un daño en los tejidos activando la quimiotaxis de macrófagos y células dendríticas ubicados en la proximidad para eliminar inmediatamente al patógeno (3). Otro mecanismo esta representado por el sistema del complemento, que promueve la fagocitosis y la lisis del agresor, mediante moléculas precursoras presentes en la sangre (4). Al ser superadas estas barreras se induce una respuesta inflamatoria (5), caracterizada por la secreción de proteínas de la fase aguda inespecíficas al antígeno y que no generan memoria. Si el proceso inflamatorio inicial no logra eliminar al patógeno, se activa el sistema inmune adaptativo. El evento inicial de la inmunidad adaptativa es la presentación antigénica, que comienza con una célula dendrítica que internaliza al patógeno, y que posteriormente procesa y presenta a los linfocitos T en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (6). El reconocimiento del antígeno por los linfocitos T induce la expresión de moléculas de adhesión, la secreción de citoquinas, tales como IL-12, y la proliferación de subclones de linfocitos T. Las citoquinas liberadas pueden direccionar la respuesta hacia un fenotipo inmune celular, mediante la secreción de Interferón-γ (IFN-γ), o uno humoral, a través de la producción de interleuquinas 4, 5 y 10 (IL-4, IL-5 e IL-10).

La respuesta inmune celular está representada por los linfocitos T citotóxicos CD8+, que se encargan de la lisis de células infectadas por virus y/o bacterias, los macrófagos, que secretan citoquinas inductoras de la proliferación de linfocitos B y T. En cambio, la respuesta inmune humoral está constituida por los linfocitos B y anticuerpos, cuyo principal blanco de acción son los patógenos extracelulares (6).



    1. 1.2 Receptores de reconocimiento de Patógenos

El sistema inmune innato reconoce motivos moleculares conservados asociados a patógenos (Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs) a través de los receptores de reconocimiento de patrones (Pattern Recognition Receptors, PRRs).

Una de las principales familias de PRRs corresponde a la de los receptores de tipo Toll (TLRs, homólogos a los Toll de Drosophila). A inicios de la década de los 90 los primeros receptores Toll de Drosophila fueron asociados con el desarrollo dorso-ventral (7), los que también cumplen un papel determinante en la respuesta inmune innata contra infecciones fúngicas, según se ha demostrado por la presencia de mutaciones en alguna de las proteínas de la ruta de señalización intracelular del mismo (8).

Los TLRs son proteínas de transmembrana que poseen un dominio intracelular TIR homólogo al del receptor de IL-1 (Toll/IL-1R), crucial en la activación de la vía de señalización del receptor. Además, el TLR posee un dominio extracelular que contiene repeticiones ricas en Leucina (Leucine Rich Repeats, LRR) involucradas en el reconocimiento de los ligandos (9).




    1. 1.3 Tipos de TLRs

Hasta el momento, 11 TLRs han sido identificados en mamíferos, agrupados en dos categorías, una que reconoce PAMPs de tipo bacteriano (TLR2, 4 y 5), localizados principalmente en la superficie celular (10), y otra compuesta por los TLR3, 7/8 y 9, que reconocen virus (10) y requieren su internalización a compartimientos endosomales (11).



TLR2, reconoce PAMPs de bacterias gram positivas, tales como peptidoglicano, lipoproteínas, lipopéptidos y ácido lipoteicoico; también puede responder a PAMPs de diversos orígenes, tales como lipoarabinomanano de Micobacteria, zimosan de Hongos y glicosilfosfatidilinositol de Tripanosoma cruzi (12).

TLR 1/6, no responden a ningún PAMPs conocido per se, sin embargo ambos forman heterodímeros con el TLR2, lo que aumenta la diversidad en el reconocimiento de PAMPs (13-15).

TLR3, reconoce RNA de doble hebra viral (dsRNA) y a la forma de doble hebra de replicación.

TLR4, responde a lipopolisacáridos (LPS) de bacterias gram negativas. La resistencia al shock endotóxico que poseen los ratones C3H/HeJ y C57BL/10ScCr es consecuencia de una mutación natural en el gen Tlr4, que disminuye la respuesta a LPS (16). El TLR4 puede reconocer PAMPs de otras especies, tales como el Taxol de Taxus brevifolia (un potente anticancerígeno humano) (17), ligandos endógenos y algunas proteínas de fusión del virus respiratorio sincicial (18).

TLR5, reconoce Flagelina, una proteína que compone al flagelo bacteriano y que está ausente en eucariontes (19). El flagelo es una de las estructuras más complejas encontradas en bacterias y está involucrado en el movimiento hacia un medioambiente óptimo para su crecimiento y sobrevida.

TLR7/8, reconocen RNA de hebra simple (ssRNA). Ambos se encuentran en el endosoma celular, exponiendo el dominio de reconocimiento de ligando en el interior del organelo y el TIR en el citoplasma (20-22).

TLR9, reconoce DNA bacteriano y/o viral, principalmente, como motivo CpG, siendo el Citomegalovirus (MCMV) (23) y el Herpes Simple 1 y 2 (HSV 1/2) ejemplos de virus que activan este receptor (24, 25).



    1. 1.4 Vía de señalización de los TLRs



La activación de casi todos los TLRs, con excepción del TLR3, estimula una vía de señalización que involucra el reclutamiento inicial de la proteína adaptadora MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88). Existen vías alternativas de transducción de señales exclusivas de cada TLR, las cuales regulan la ruta de señalización clásica y son, en general, independientes de la participación de MyD88. El estudio riguroso de los mecanismos blanco de una de estas vías, que involucra a la PI3K, es parte central de esta tesis.



      1. Ruta de señalización dependiente de MyD88

El dominio TIR de los TLRs inicia la vía de señalización mediante el reclutamiento de la molécula adaptadora MyD88 y posteriormente de proteínas quinasas. MyD88 es una proteína de 35 kDa que presenta tres dominios funcionales: un TIR en el carboxilo terminal, por el cual se asocia al TLR (26, 27); uno de muerte (DD) en el amino terminal, que media la interacción con DD presentes en otras proteínas (28); y uno intermedio (DI), el cual activa, río abajo, a proteínas quinasas asociadas al receptor de IL-1 (IRAKs).

La familia de las IRAKs esta compuesta por cuatro integrantes: IRAK-1, -2, -4 y -M, las cuales poseen un DD en el amino terminal y un dominio con actividad quinasa en su región central. No obstante, solo IRAK-1 y -4 presentan actividad quinásica, ya que IRAK-2 y -M inhiben la ruta de señalización de IL-1/TLR. La forma fosforilada de IRAK-4 media la fosforilación de IRAK-1, lo que permite que IRAK-1 se escinda del complejo TIR/MyD88/IRAK-4/-1, y así interaccionar, subsecuentemente, con TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6) (29).

TRAF6 es una molécula adaptadora que se encuentra en el citoplasma y que se activa posterior a IRAK en la cascada de señalización de los TLRs (Figura 1).

TRAF6 también activa a las quinasas (IKKs) del inhibidor del factor nuclear-B (IB) y a las activadas por mitógeno (MAPKs) (30, 31, 32).

Las IKKs activadas fosforilan a IκB, el cual se escinde del complejo que forma con las subunidades que conforman el factor nuclear-κB (NFB), para ser ubiquitinizado y posteriormente degradado por el proteosoma. Cuando NFB se disocia del complejo se transloca al núcleo y activa la transcripción de genes pro-inflamatorios y de moléculas de adhesión (Figura 1).




Figura 1. Vía de señalización de los receptores de tipo Toll (TLRs) dependiente de MyD88. La activación de los TLRs induce una ruta de señalización transduccional, mediada principalmente por MyD88 y NFB, activando la transcripción de genes pro-inflamatorios y moléculas de adhesión (Adaptado de (113)).


      1. Ruta de señalización intracelular independiente de MyD88

Algunos de los integrantes de la familia de los TLRs no requieren de la participación de MyD88 para activar respuestas inmunes innatas. La activación de TLR3 y TLR4 involucra una vía de señalización alternativa, que cuenta con la intervención de la proteína adaptadora TRIF (TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β) y TRAM (TRIF-related adaptor molecule), además de los factores reguladores de interferon 3 y 7 (IRF-3/7) que inducen la expresión de IFN tipo I y moléculas co-estimulatorias (25, 33).



1.5 Participación de la fosfoinositol 3-quinasa en la ruta de señalización del TLR
Otras vías de señalización intracelular producto de la activación de algunos TLRs, involucran la participación de la fosfoinositol 3-quinasa (PI3K). El dominio TIR de TLR2, TLR1, TLR6 y TLR3 posee motivos YXXM susceptibles a fosforilación por tirosina quinasas, los que son reconocidos por los dominios SH2 de la enzima PI3K. Cuando PI3K se une a las tirosinas fosforiladas del dominio TIR, activa la fosforilación de fosfoinositoles (o sus derivados en el hidroxilo en la posición 3) localizados en la membrana plasmática, los que son reconocidos por los dominios de Pleckstrina (PH domain) presentes en la serina/treonina quinasa Akt (PKB) y en proteínas dependientes de fosfoinositoles (PDK1/2), promoviendo rápidamente la fosforilación de Akt y la expresión de genes anti- o pro-inflamatorios, mediante NFB, IRF-3 y AP-1, dependiendo del TLR, del estímulo y del tipo celular (34, 35). En este sentido, el estado de fosforilación de Akt es un indicador de la actividad de la ruta de PI3K.

Los fosfoinositoles blanco de la PI3K se ubican en la cara citoplasmática de la membrana celular, regulando el tráfico vesicular, la organización del citoesqueleto, la transducción de señales, la fagocitosis, la proliferación celular, la sobrevida celular y la respuesta inmune (36-39), como también el reclutamiento de proteínas específicas a nivel de la membrana plasmática (40, 41).

Hasta el momento, se han identificado in vivo cuatro fosfoinositoles fosforilados siendo los principales, en la respuesta inducida por los TLRs, el fosfoinositol (3,4)-bifosfato (PIP2) y el fosfoinositol (3,4,5)-trifosfato (PIP3), los cuales se producen en respuesta a factores de crecimiento, citoquinas, etc (39).

PI3K fue inicialmente purificada y clonada como un heterodímero compuesto por una subunidad catalítica de 110 kDa (p110α) y una reguladora de 85 kDa (p85α).

Existen 8 tipos de PI3Ks en mamíferos y se clasifican en I, II y III, de acuerdo a la estructura de sus subunidades, la selectividad por el sustrato y el tipo celular en el que se expresan (41).

La clase I comprende dos subclases, Ia y Ib, los cuales generan el PIP3, uno de los segundos mensajeros lipídicos más relevantes en el sistema inmune. La subclase Ia está compuesta por tres subunidades catalíticas, p110α, p110β y p110δ, y cinco regulatorias p85α, p85β, p55γ, p55α, y p50α. La preferencia en la expresión de cada subunidad regulatoria y catalítica está dada por el tipo celular (42). La subunidad p85α posee dominios SH2 por lo que interacciona con proteínas fosforiladas en tirosina, especialmente con el TLR1, TLR6, TLR2 y TLR3, y una región inter-SH2 a través de la que dimeriza con p110 (43). El subgrupo Ib esta compuesto solo por un integrante catalítico (p110γ) expresado inicialmente en leucocitos y uno regulatorio (p101) activado por asociación con proteínas G.

Las PI3K de clase II han sido poco estudiadas, y su mecanismo de acción estaría relacionado con la producción de fosfoinositol 3-monofosfato (P3P) y PIP2 (44). La clase III, que solo genera P3P se localiza en vesículas endocíticas y principalmente regularía la fagocitosis (38).

El PIP3 recluta distintas proteínas quinasa, tales como la dependiente de fosfoinositol (PDK-1), Akt y la proteína quinasa C ζ (PKC ζ), quienes median la transcripción de genes, la sobrevida y el crecimiento celular (45-48).


Akt es el homólogo celular del oncogen transformante del retrovirus AKT8 (87-89). Hasta el momento tres familias de Akt han sido descritas en mamíferos (89-92).

La familia de proteínas Akt poseen un motivo central con actividad quinasa y en el amino terminal un dominio PH, el cual media las interacciones lípido-proteína y/o proteína-proteína (93-95). Además, Akt regula la fosforilación de múltiples sustratos, tales como la proteína Bcl-2 antagonista de la muerte celular (BAD), involucrada en apoptosis, las quinasas IKKs, involucradas en apoptósis, vías de sobrevivencia celular y respuesta inmune, el apoptosoma, y la quinasa sintetizadora de glicógeno 3 (GSK-3), entre otros (96, 97).

PI3K regula el desarrollo de los linfocitos B (50) y el reconocimiento antigénico de los linfocitos T por asociación al dominio citoplasmático de su receptor (T Cell Receptor; TCR) (51).

Otras funciones de la vía de PI3K vinculadas con el sistema inmune innato, han sido la quimiotaxis de fagocitos (52) y la regulación de la actividad de células NK en el rechazo a transplantes, tumores y virus (53-55).




1.6 Participación de los Glucocorticoides en el sistema inmune
Las hormonas esteroidales han sido reconocidas como moduladores esenciales de diversos procesos celulares, tales como transducción de señales, comunicación intercelular y metabolismo intermedio, entre otros (56). Los glucocorticoides (GCs) son sintetizados en la zona fasciculada/reticulada de la corteza adrenal y liberados a la circulación en respuesta a estímulos relacionados con el estrés.

La secreción de los GCs es orquestada por el eje Hipotálamo-Hipófisis-Glándula Adrenal (HPA), mediante la secreción hipotalámica de la hormona liberadora de corticotropina, que activa la liberación de la hormona adrenocorticotropina (ACTH), la cual finalmente, activa receptores específicos en la glándula adrenal.


Los GCs circulan en el plasma asociados a moléculas transportadoras, tales como la globulina y la albúmina, que une ligandos endógenos y/o sintéticos, respectivamente (57). Estas moléculas participan en el metabolismo de carbohidratos, proteínas y lípidos, regulando la glicemia, y el procesamiento de estos en aminoácidos y ácidos grasos libres, respectivamente. Los tejidos blanco de los GCs son el sistema nervioso central, el cardiovascular, regulando la tensión vascular, y en el sistema inmune, disminuyendo la expresión de moléculas de la inmunidad adaptativa (58).

Estas moléculas lipofílicas atraviesan la bicapa lipídica de la célula mediante difusión simple, sin embargo el efecto de los GCs en algunos tipos celulares estaría vinculada con la unión a receptores de membrana (56, 59). El mecanismo de acción conocido de los GCs involucra su unión a un receptor citoplasmático (GR), el cual activa la expresión de genes, tales como IBα, e inhibe la actividad transcripcional de NFB y AP-1, mediante interacción proteína-proteína (5, 60). En ausencia de GCs, GR se encuentra inactivo en el citoplasma asociado a proteínas de shock térmico 56, 70 y 90 (hsp56, hsp70 y hsp90) (61, 62), y presenta una gran afinidad por el ligando.

Los GCs sintéticos son utilizados para el tratamiento de enfermedades, tales como Lupus Eritematoso Sistémico, Enfermedad Inflamatoria Intestinal, Psoriasis, Asma y Artritis Reumatoidea (63, 64). El aspecto más relevante de la asociación de GCs con el sistema inmune corresponde al potente efecto supresor de la inflamación y la respuesta inmune adaptativa. El mecanismo inmunosupresor de los GCs se vincula con la inducción de la apoptosis, la disminución de la proliferación linfocitaria, la supresión de la expresión de citoquinas pro-inflamatorias y la disminución de la secreción de anticuerpos por los linfocitos B (5, 65, 66).

1.7 Regulación de la expresión del TLR por moléculas pro- y anti-inflamatorias
La expresión de los TLRs puede ser modulada por diversos factores involucrados en vías pro- o anti-inflamatorias, tales como citoquinas y GCs, respectivamente (1).

Las moléculas que forman parte de la vía de señalización del TLR2 son blancos posibles del GR, por lo cual es pertinente estudiar la participación de PI3K en estos mecanismos de señalización intracelular. Estudios recientes indican que el GC sintético Dexametasona, en combinación con TNFα, aumenta sinérgicamente la expresión del receptor TLR2 en células A549 (1), y la inhibición de la apoptosis (67). Por otra parte, Dexametasona reduce la fosforilación de Akt en mastocitos (70). Estos resultados proponen nuevas perspectivas de los GCs en la respuesta inmune innata, que clásicamente han sido vinculados con la inhibición de la expresión de moléculas de la inmunidad adaptativa. Por estas razones, en esta tesis, se estudia el efecto de los GCs sobre la vía de transducción de los TLRs.




  1. HIPÓTESIS

La activación del TLR2 por lipopéptidos bacterianos sintéticos activa una vía clásica de señalización que es mediada por MyD88. Sin embargo, estudios recientes indican que la activación del TLR2 también involucra una vía alternativa mediada por PI3K/Akt (35, 68). Estudios preliminares indican que el tratamiento de células A549 con un agonista sintético del TLR2, análogo a la porción amino terminal de lipoproteínas bacterianas (Pam3Cys-Ser-Lys4), aumenta la actividad transcripcional del TLR2. Una interrogante en estos procesos ha sido el efecto de los GCs sobre estas vías. GR activado por Dexametasona puede interaccionar y regular la actividad de PI3K en queratinocitos, mastocitos y neutrófilos (69, 70).

Basándome en estos antecedentes, la hipótesis de esta tesis para optar al grado de Bioquímico es:

La fosfoinositol 3-quinasa regula negativamente la producción de TNFα inducida por agentes de bacterias gram positivas, en presencia o ausencia de glucocorticoides”




    1. 2.1 Objetivo General



Determinar la participación de PI3K en la producción de TNFα inducida por productos de bacterias gram positivas, en presencia o ausencia de glucocorticoides, y las vías involucradas en estos procesos.



    1. 2.2 Objetivos Específicos




  1. Analizar el efecto de Pam3Cys-Ser-Lys4 y Dexametasona, sobre la expresión de TNFα y la activación transcripcional de NFB, en células A549.




  1. Estudiar la participación de PI3K-Akt en la ruta de señalización del TLR2 inducida por Pam3Cys-Ser-Lys4 y Dexametasona.

2.1) Para ello se evaluó el estado funcional de Akt, determinado por su estado de fosforilación.

Se determinó el efecto de la intervención de la enzima, en condiciones de activación del TLR2 y GR, sobre:

2.2) La producción de TNFα

2.3) La actividad transcripcional mediada por NFB

2.4) La actividad transcripcional mediada por AP-1

2.5) La activación transcripcional del promotor del TLR2




  1. Determinar la interacción entre TLR2-PI3K y GR-PI3K.

3.1) Analizar la presencia de sitios putativos de reclutamiento de dominios SH2 de p85, con el programa DS Gene.

3.2) Estudiar la interacción de estas proteínas sobre-expresadas in vitro mediante co-inmunoprecipitación.



2.3 Diseño Experimental
Para desarrollar el objetivo específico 1: “Analizar el efecto de Pam3Cys-Ser-Lys4 y Dexametasona, sobre la expresión de TNFα y la activación transcripcional de NFB en células A549”.

a) Se determinó la expresión intracelular de TNFα en células expuestas al agonista del TLR2 en un rango de dosis (0,1 a 20 µg/ml), por citometría de flujo. b) Se estudió la actividad transcripcional de NFB utilizando un constructo que contiene el gen reportero luciferasa (3xMHC-Luc). Este vector se expresó transitoriamente en células A549 que se estimularon posteriormente con Pam3Cys-Ser-Lys4 en presencia o ausencia de Dexametasona. La actividad transcripcional de NFB fue proporcional a la actividad de la luciferasa.


Para Evaluar el Objetivo específico 2, “Estudiar la participación de PI3K-Akt en la ruta de señalización del TLR2 inducida por Pam3Cys-Ser-Lys4 en presencia o ausencia de Dexametasona”.

a) Se determinó la fosforilación de Akt mediante inmunoblots de extractos proteicos totales de células A549 expuestas a Pam3Cys-Ser-Lys4 en presencia o ausencia de Dexametasona.

En todos estos estudios se intervino la actividad de la PI3K con un mutante de la subunidad regulatoria p85 (p85-DN, ver en materiales y métodos)

b) La actividad transcripcional mediada por NFB.

c) La actividad transcripcional mediada por AP-1.

d) La activación transcripcional del promotor del TLR2:

Para determinar la actividad transcripcional de NFB, AP-1 y TLR2, las células se co-transfectaron transitoriamente con los constructos 3xMHC-Luc, AP-1-Luc y TLR2-1486-Luc (ver detalles en sección de materiales y métodos). Las células A549 se estimularon posteriormente con distintas dosis de Pam3Cys-Ser-Lys4 (0,1, 1 y 20 µg/ml) y Dexametasona 100 nM, y se determinó la actividad de la luciferasa.
e) Para determinar la expresión intracelular de TNFα en células A549 expuestas a Pam3Cys-Ser-Lys4 en presencia o ausencia de Dexametasona, se realizó la tinción intracelular con anticuerpos conjugados específicos y se cuantificó el contenido por citometría de flujo.
Para evaluar el Objetivo específico 3: “Determinar la interacción entre TLR2-PI3K y GR-PI3K”, se realizaron co-inmunoprecipitaciones de las fracciones proteicas de células A549 que expresan transitoriamente los vectores que contienen el cDNA de las proteínas cuya interacción será evaluada (p85, GR y/o TLR2-Flag). Previo a la obtención de las fracciones proteicas, las células A549 se estimularon con Pam3Cys-Ser-Lys4 en presencia o ausencia de Dexametasona 100 nM. Para realizar los ensayos de co-inmunoprecipitación, se utilizaron anticuerpos específicos dirigidos contra cada una de las proteínas en estudio y se resolvieron posteriormente por inmunoblots.


3. MATERIALES Y MÉTODOS

  1   2   3


La base de datos está protegida por derechos de autor ©bazica.org 2016
enviar mensaje

    Página principal