Actividad amebicida, toxica y citotoxica de heliotropium amplexicaule



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ACTIVIDAD AMEBICIDA, TOXICA Y CITOTOXICA DE Heliotropium amplexicaule
Catalina Leos Rivasa, Maria Julia Verde Strara, Maria Azucena Oranday Cárdenasa, Ledy Elizabeth Garcia Becerraa, Catalina Rivas Moralesa
aUniversidad Autonoma de Nuevo Leon, Facultad de Ciencias Biologias. Av. Pedro de Alba s/n Cd Universitaria, San Nicolas de los Garza, Nuevo Leon, Mexico. catalinaleosrivas@yahoo.com

ResumEN:

H. amplexicaule es una planta perteneciente a la familia Boraginacea con antecedentes de contenido de compuestos con interés farmacológico. En este estudio se investigó la actividad biológica de los extractos metanólicos de raíz, tallo, flor y hojas de H. amplexicaule. Los resultados mostraron un efecto amebicida significativo sobre Entamoeba histolytica HM1-IMSS con IC50 de 2, 8, 36 y 114.2 µg/mL para raíz, tallo, flor y hojas respectivamente. Sobre la línea celular Vero presentaron CI50 de: 250, 200, 175 y 150 µg/mL para raíz, tallo, hoja y flor respectivamente; ninguno de los extractos mostró toxicidad sobre A. salina con una LD50> 1,000 µg/ml. El extracto que presento mayor actividad amebicida fue el de raíz con un índice terapéutico de 125.
Introducción

Se ha reportado el incremento de resistencia de los microrganismos a los diferentes antibióticos utilizados para su tratamiento, por otro lado también tenemos el problema de los efectos secundarios que producen estos antibióticos los cuales no solo matan a el microorganismo sino que también dañan al hospedero. Desde la antigüedad las plantas medicinales han sido utilizadas por los indígenas para tratar diversos padecimientos, es por eso que basándose en el conocimiento ancestral se trata de rescatar esta práctica no solo para conservar tradiciones sino también para la atención primaria de la población, así como para la obtención de nuevos fármacos que sean eficientes contra los microorganismos pero al mismo tiempo gentiles con el hospedero1. México es posee una biodiversidad bastante amplia, en la cual se tienen identificadas más de 5,000 especies con aplicaciones curativas las cuales no han sido validadas cientificamente.

Los paracitos son un problema de salud pública, en especial E. histolytica, ya que esta es responsable de 40 000 a 100 000 muertes anualmente a nivel mundial, dicho parasito además ha reportado resistencia a el fármaco utilizado en su tratamieto, el metronidazol, además este fármaco tiene una gran cantidad de efectos secundarios debido a que tiene propiedades carcinogénicas, teratogénicas y embriogénicas2.

Por lo antes mencionado es por lo que en la actualidad se están estudiando alternativas de origen natural que sean eficaces contra el patógeno pero al mismo tiempo no presenten efectos secundarios o que estos sean mínimos, es por esto que en la actualidad se ha puesto un principal interés en los extractos de plantas con antecedentes etnobotánicos, se tienen reportes de compuestos con actividad antiprotozoario otenidas de plantas como la emetina, la quinina y la artemisinina, aislados de especies de plantas superiores2; para poder validar estos compuestos se lleva a cabo la investigación fitoquímica, la cual tiene como objetivo principal aislar principios activos, identificarlos, determinar su estructura y encontrar sus posibles aplicaciones.

Es este estudio se pone atención en familia Boraginaceae que comprende alrededor de 130 géneros y 2600 especies distribuidas en zonas tropicales, se tiene reportes de compuestos es esta familia como terpenos, alcaloides pirrolizados, flavonoides y naftaquinonas, también se tiene evidencia del uso etnofarmacológico de algunas especies de esta familia para combatir diversas enfermedades como diarreas, infecciones y parásitos intestinales3,4,5. En un estudio realizado por Perianayagam et al6 se evaluó la actividad antimicrobiana de compuestos aislados del extracto etanólico de raíz de Trichodesma indicum y se encontró que el extracto posee una potente actividad contra S. aureus, B. subtilis y C. albicans con una CMI de 19.2 µg/mL y algunos de los compuestos presentaron actividad antibacterial sobre S. aureus con CMI de 2.4 µg/mL. También de esta familia se ha estudiado Bourreria spathulata la que de forma tradicional se utiliza para combatir a la malaria en Panamá, dicho uso fue corroborado científicamente por Calderón et al7 observando una IC50 menor a 10 µg/mL. La planta estudiada en este trabajo es H. amplexicaule, de este género se tiene reporte de poseer alcaloides pirrolizados, flavonoides y derivados aromáticos del geranil, hay aproximadamente 250 especies distribuidas en ambos hemisferios8.
PARTE EXPERIMENTAL

La planta fue colectada en Monterrey, Nuevo Leon, se identificó en el herbario de la Facultad de Ciencias Biológicas, UANL con número de identificación 25527, la planta fue secada y separada en hojas, flor, tallos y raíz esta se trituro y se obtuvo el extracto metanólico por medio de maceración utilizando 30 g de planta en 250 mL del solvente y se mantuvo en agitación por siete días, el extracto se filtró y se evaporo hasta sequedad con presión reducida en un rotavapor.


Toxicidad sobre Artemia salina

La A. salina con 48 h de eclosionada en agua de mar artificial (Instant Ocean) se pusieron en microplacas de 96 pozos (10 artemias/pozo/100µL) , a los pozos se les adiciono 100 µL de cada una de las concentraciones probadas (0, 100, 300, 500 y 100 µL) de los diferentes extractos, una vez agregadas las concentraciones se incubaron por 24 h9 pasado este tiempo se contó la cantidad de artemias muertas/total para determinar la viabilidad y la dosis letal 50% (DL50), se realizó por triplicado de manera independiente y se calculó la desviación estándar. Según el criterio de toxicidad tomado en cuenta para este trabajo se considera toxica una CL50 < 500 µL, toxicidad débil > 500 < 1000 µL y no toxico > 1000 µL.10


Actividad sobre E. histolytica

Para determinar la actividad amebicida se realizó de acuerdo a lo descrito por Leos-Rivas et al11,12 para probar los extractos se preparó una solución stock de 40 mg/mL en dimetil sulfóxido (DMSO) y se esterilizaron por filtración, a partir de esta se perpararon cinco concentraciones (2, 20, 60, 100 y 200 µL) en 5 mL de medio TYI-S-33 suplementado con 10% suero y 1% Penicilina/Esterptomicina, para el ensayo se emplearon tubos de boro silicato con tapon de rosca 13X100 mm, en estos se inocularon con 1x104 cel/mL y se pusieron a incubación a 37°C por 6 d para posteriormente determinarse la densidad con la ayuda de un hemocitómetro, como control positivo se utilizó metronidazol y la Conentración Inhibitoria Media se obtuvo utilizando la prueba Probit13.


Citotoxicidad

Para esta determinación se utilizaron células Vero de riñón de mono verde africano (American Type Culture Collection: CCL-81) cultivadas en medio M-199 (Gibco, cat. 11150-059) con 4% de suero fetal bovino y 1% de Penicilina/Estreptomicina con atmósfera húmeda, 5% de CO2 a 37°C, el ensayo se realizó en microplacas de 96 pozos con 3x106 celulas/pozo en 100 µL del medio anteriormente descrito y fue incubada a 37°C en las mismas condiciones por 24h después de este periodo a cada pozo se le adiciono 100 µL de medio de cultivo con los extractos a probar en sus diferentes concentraciones (0, 100, 300, 500 y 1000 µL) y se incubaron 24 h más, pasado este periodo de tiempo se le adiciono 10 µL del reactivo Cell Titer-Blue (Promega, cat. G8080) a cada pozo y se incubo por 2 h para posteriormente medir la absorbancia a 550 nm en un lector de microplacas (Biotek, Modelo ELX800), el control positivo utilizado fue Triton X-100 2.5%, con los datos obtenidos se determino el porcentaje de viabilidad y la Concentración Inhibitoria 50% (IC50).


Pruebas Fitoquímicas

A los extractos metanolicos se les realizaron la pruebas químicas convencionales para así poder identificar parcialmente los grupos funcionales presentes14.


RESULTADOS

Los resultados se presentan en la Tabla 1 en donde se observa que el extracto que presento una mayor actividad sobre E. histolytica fue el de raíz el cual al mismo tiempo mostro una menor toxicidad sobere células vero y según los criterios de toxicidad sobre A. salina no presentó toxicidad.




H. amplexicaule

CI50 E. histolytica (µg/mL)

CI50 células vero (µg/mL)

DL50 A. salina (µg/mL)

Tallo

8

200

> 1,000

Hojas

114

175

> 1,000

Raíz

2

250

> 1,000

Flor

36

150

> 1,000

Control Positivo

0.0846

25

50

Todos los extractos mostraron actividad sobre E. histolytica lo cual concuerda con reportes previos dentro de la familia Boraginaceae como lo reportado para Turnefortia densiflora con una IC50 de 69.1 µL/mL 15 y para Borago officinalis con una IC50 de 33 µL/mL11. En cuanto a su toxicidad según el criterio tomado en cuenta10 ninguno de los extractos es considerado toxico y en cuanto a los valores obtenidos en el ensayo de citotoxicidad sobre células Vero los cuales fueron CI50 de: 175, 250, 150, y 200 µg/mL para hoja, raíz, flor y tallo respectivamente. Lo que resalta de estos resultados es el extracto metanólico de raíz ya que en este la CI50 para las células Vero es de 250 µg/mL mientras que la CI50 para E. histolytica es de 2.0 µg/mL, por lo que resulta 125 veces menor la dosis para E. histolytica lo cual indica que el extracto es especifico, sin embargo se recomienda que el H. amplexicaule (heliotropo) sea consumido por periodos cortos debido a que contiene alcaloides del tipo pirrolizidínicos que pueden causar daño en hígado16.

Los extractos metanólicos contienen lactonas, fenoles, azúcares, terpenos, esteroles y alcaloides. El potencial terapéutico de plantas de la familia Boraginaceae, ha sido demostrado y atribuido a compuestos fitoquímicos polares como compuestos fenólicos, quinonas y alcaloides8.
CONCLUSIONES

Los extractos metanolicos de H. amplexicaule poseen una actividad amebicida relevante con una CI50 de 114, 2, 36 y 8 µg/mL para hojas, raíz, inflorescencias y tallos respectivamente, baja citotoxicidad para las células Vero y no presenta toxicidad sobre A. salina. Estos resultados indican que H. amplexicaule tiene potencial para combatir infecciones gastrointestinales causadas por E. histolytica y amerita futuros estudios en aplicaciones clínicas para los extractos de esta planta.


Agradecimientos

Este trabajo es parte de la tesis doctoral de Catalina Leos Rivas con apoyo CONAYT No. 204599 y la Universidad Autónoma de Nuevo León (Proyecto PAICYT-CA1502-07)



BIBLIOGRAFÍA

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