Actividades del año 2009 Loque Americana Adriana Mónica Alippi



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Actividades del año 2009

Loque Americana

Adriana Mónica Alippi

Laboratorio de Referencia de loque Americana - Unidad de Bacteriología CIDEFI (UB-CIDEFI)


Facultad de Ciencias Agrarias Y Forestales - Universidad Nacional de La Plata
Calle 60 y 119 S/N c.c. 31. 1900 La Plata, Argentina

Tel. (0221) 423-6758 int. 423 Fax (0221) 425-2346



e-mail: alippi@biol.unlp.edu.ar; adrianaalippi@gmail.com

Resumen de las actividades generales relacionadas con la enfermedad

1. Prueba(s) que se usa(n)/o disponible(s) para la enfermedad especificada, en su laboratorio

Prueba

Técnica

Especificidad

Total

Detección de esporas de Paenibacillus larvae en restos larvales

Coloración - Microscopía

N/A

90

Detección de P. larvae en restos larvales

PCR

específica

6

Aislamiento de P. larvae de restos larvaes

Aislamiento en medios de cultivo semi-selectivos y confirmación por PCR y especificidad frente al fago PPL1

específica

3

Detección de esporas viables de P. larvae en miel


Aislamiento en medios de cultivo semi-selectivos y confirmación por PCR y especificidad frente al fago PPL1

específica

24

Detección de esporas de P .larvae a partir de abejas adultas


Aislamiento en medios de cultivo semi-selectivos y confirmación por PCR y especificidad frente al fago PPL1

específica

10

Test de susceptibilidad por difusión en disco


Pruebas de susceptibilidad/resistencia a antibióticos

Resistencia antimicrobiana frente a tetraciclina, minociclina y oxitetraciclina en cepas de P. larvae y otras especies esporuladas presentes en miel.

180

Determinación de concentración inhibitoria mínima.


Pruebas de susceptibilidad/resistencia a antibióticos

Resistencia antimicrobiana frente a tetraciclina, minociclina y oxitetraciclina en cepas de P. larvae y otras especies esporuladas presentes en miel.

180

Detección molecular de genes de resistencia a tetraciclina/s por PCR


PCR

Especificidad para determinantes de resistencia a tetraciclina y oxitetraciclina

180

“Fingerprints” de ADN para caracterizar cepas bacterianas.


Rep-PCR

Tipificación genotípica de cepas de P. larvae

27

Técnicas de diagnóstico empleadas:

  1. Técnicas de coloración de restos larvales en colmenas con síntomatología clínica: Hanging drop modificada, Tinción simple, Coloración negativa con nigrosina. (Ref. Alippi, A.M. A comparison of laboratory techniques for the detection of significant bacteria of the honey bee Apis mellifera L. in Argentina. Journal of Apicultural Research 30: 75-80, 1991; De Graaf, D.C. Alippi, A.M., Brown, M. , Evans, J.D.; Feldlaufer, M., Gregorc, A., Hornitzky, M., Pernal, S:F:, Schuch, D.M.T., Titĕra, D., Tomkies, V. and Ritter, W. Under the microscope. Diagnosis of American foulbrood disease in honeybees: A synthesis and proposed analytical protocols. Letters in Applied Microbiology, 43: 583-590, 2006).

  2. Aislamiento y cultivo de Paenibacillus larvae a partir de larvas con síntomas clínicos mediante medios semi-selectivos (agar MYPGP adicionado con ác. nalidíxico) (Ref. Alippi, A.M. A comparison of laboratory techniques for the detection of significant bacteria of the honey bee Apis mellifera L. in Argentina. Journal of Apicultural Research 30: 75-80, 1991)

  3. Detección de esporas de Paenibacillus larvae a partir de abejas adultas mediante aislamiento y cultivo en medios semi-selectivos (agar MYPGP adicionado con ác. nalidíxico) (Ref. Hornitzky, M.A.Z. & Karlovskis, S. A culture technique for the detection of Bacillus larvae in honeybees. Journal of Apicultural Research 28: 118-120, 1989)

  4. Aislamiento de Paenibacillus larvae a partir de mieles contaminadas mediante medios semi-selectivos (agar MYPGP adicionado con ác. nalidíxico + ác. pipemídico; agar BL adicionado con ác. nalidíxico + ác. pipemídico). (Ref. Alippi, A.M. Detection of Bacillus larvae spores in Argentinian honeys by using a semi-selective medium. Microbiología SEM 11: 343-350, 1995)

  5. Tipificación de cepas de Paenibacillus larvae mediante el bacteriófago específico PPL1 (Ref. Stahly, D.P., Alippi, A.M., Bakhiet, N. Campana, C.F., Novak, C.C. & Cox, R. PPL1c, a virulent mutant bacteriophage useful for identification of Paenibacillus larvae subspecies larvae. Journal of Invertebrate Pathology, 74: 295-296, 1999).

  6. Tipificación genotípica por PCR específica con primers PL1/PL2 (Ref. Govan V.A.; Allsopp, M.H. & Davidson, S. A PCR detection method for rapid identification of Paenibacillus larvae. Applied and Environmental Microbiology 65: 2243-2245, 1999).

  7. PCR para la detección directa de Paenibacillus larvae a partir de larvas con síntomas clínicos de la enfermedad. (Ref. Alippi A.M., López, A.C., & Aguilar O.M. A PCR based method that permits specific detection of Paenibacillus larvae subsp. larvae, the cause of American Foulbrood of honey bees, at the subspecies level. Letters in Applied Microbiology 39: 25-33, 2004).

  8. Tipificación genotípica de cepas de Paenibacillus larvae por rep-PCR empleando primers BOX, ERIC y REP (Ref. Alippi, A.M. & Aguilar, O.M. Characterization of isolates of Paenibacillus larvae subsp. larvae from diverse geographical origin by the polymerase chain reaction and Box primers. Journal of Invertebrate Pathology, 72(1): 21-27, 1998; Alippi A.M., Reynaldi, F.J., López, A.C., De Giusti, M.R. & Aguilar O.M. Molecular epidemiology of Paenibacillus larvae larvae and incidence of American Foulbrood in Argentinean honeys from Buenos Aires Province. Journal of Apicultural Research 43(3): 135-143, 2004).

  9. Determinación de resistencia-susceptibilidad a tetraciclinas por métodos microbiológicos clásicos en cepas de Paenibacillus larvae (pruebas de difusión en disco y determinación de concentraciones inhibitorias mínimas) (Ref. Alippi, A.M., López A.C., Reynaldi F.J., Grasso, D.H., and Aguilar O.M. Evidence for plasmid-mediated tetracycline resistance in Paenibacillus larvae, the causal agent of a honey bee larval disease. Veterinary Microbiology 125: 290-303, 2007).

  10. Detección de determinantes de resistencia a tetraciclina y oxitetraciclina en cepas de Paenibacillus larvae por PCR. (Ref. Alippi, A.M., López A.C., Reynaldi F.J., Grasso, D.H., and Aguilar O.M. Evidence for plasmid-mediated tetracycline resistance in Paenibacillus larvae, the causal agent of a honey bee larval disease. Veterinary Microbiology 125: 290-303, 2007; Lopez, A.C., De Ortuzar R.V.M. & Alippi, A.M. Tetracycline and Oxytetracycline resistance determinants detected in Bacillus cereus strains isolated from honey samples. Revista Argentina de Microbiología, 40: 231-236, 2008)

2. Producción y distribución de reactivos de diagnóstico

Ninguno (No se aplica para esta enfermedad)



Actividades específicamente relacionadas con el mandato
de los Laboratorios de Referencia de la OIE


3. Armonización y normalización internacional de los métodos para las pruebas de diagnóstico o la producción y el análisis de vacunas

Puesta a punto de técnicas de detección de Paenibacillus larvae mediante técnicas de microbiología clásica y marcadores moleculares que se emplean en este laboratorio para el diagnóstico de rutina y han sido publicadas en distintas revistas con referato internacional.



4. Preparación y suministro de estándares internacionales de referencia para las pruebas de diagnóstico o las vacunas

Se proveyeron dos cepa de referencia de Paenibacillus larvae tipificada genotípica y fenotípicamente a la Dr. Carina Audisio, INIQUI-CONICET, UNSa, Salta, Argentina. Junio de 2009; 1 cepa de referencia de Paenibacillus larvae tipificada genotípica y a la Universidad Nacional de Santiago del Estero, Argentina y un templado de ADN de P. larvae para el laboratorio de Biología Molecular – Laboratorio Animal, SENASA, Martínez, Buenos Aires, Argentina.



5. Investigación y desarrollo de nuevos procedimientos para el diagnóstico y el control

Se continuó con el desarrollo de los diferentes objetivos planteados que se resumen a continuación:



  • Evaluar antibióticos alternativos a oxitetraciclina y de baja o nula residualidad para el control de loque americana en colmenas afectadas.

Se realizaron estudios para evaluar la dosis adecuada de tartrato de tilosina para el control a campo de loque americana en colmenas de abejas melíferas administrado en forma de “paper pack”, así como la influencia del uso de gelatina de cereza como saborizante en la formulación. La ausencia de larvas enfermas con síntomas clínicos de loque americana demostró que la dosis de 1 g de tilosina fue la más eficaz in vivo. Por otro lado se demostró el aumento de la palatabilidad del antibiótico con el uso del saborizante empleado.

  • Investigar la diversidad fisiológica y quimiotaxonómica en las poblaciones de Paenibacillus larvae, Bacillus cereus, Bacillus megaterium y especies relacionadas presentes en miel.

Se evaluaron 132 aislamientos de Bacillus cereus y 52 de Bacillus megaterium provenientes de mieles de distintos orígenes geográficos para investigar la presencia de secuencias de DNA relacionados con genes de virulencia y su posible correlación con la actividad hemolítica y coagulasa. Con respecto a los genes de virulencia, se analizaron por PCR secuencias de DNA de los genes nhe (A, B y C), HBL (A, B, C, D), cytK y bceT. La relación entre las variables fue evaluada mediante un análisis de componentes principales, dónde se encontró que los aislamientos de B. cereus mostraron una correlación positiva entre actividad coagulasa (coagulasa libre) y presencia de los genes del complejo HBL y bceT, mientras que en B. megaterium se halló una alta correlación positiva entre actividad coagulasa (libre y fija) y actividad hemolítica, pero no se observó relación significativa entre la presencia de genes de virulencia y los otros factores de virulencia evaluados. Este estudio constituye el primer registro de la presencia de genes (cyt K y NHE) en cepas de B. megaterium y el primer registro de la relación entre la actividad coagulasa y la presencia de genes de virulencia en B. cereus y B. megaterium.

Nuestros hallazgos sugieren que la miel podría vehiculizar enfermedades transmisibles por alimentos debido a la presencia de cepas de B. cereus y B. megaterium potencialmente tóxicas.



  • Investigar las bases genéticas de la resistencia a tetraciclina en las poblaciones de P. larvae y otras especie de Paenibacillus y Bacillus comúnmente presentes en miel.

Se continúa con la caracterización del plásmido pPL374 presente en cepas de Paenibacillus larvae de alta resistencia a tetraciclina transmisible por conjugación. Se efectuaron nuevos ensayos de conjugación entre cepas dadoras del plásmido y otras cepas bacterianas esporuladas presentes en miel empleando técnicas previamente descritas (Alippi, A.M., López A.C., Reynaldi F.J., Grasso, D.H., and Aguilar O.M. Evidence for plasmid-mediated tetracycline resistance in Paenibacillus larvae, the causal agent of a honey bee larval disease. Veterinary Microbiology 125: 290-303, 2007).

Se investigó la presencia de diversos determinantes de resistencia a tetraciclina y oxitetraciclina en las poblaciones de Bacillus cereus presentes en la miel. De un total de 77 aislamientos evaluados, 30 (39%) resultaron resistentes a tetraciclina y/o minociclina de acuerdo con los resultados de las pruebas de difusión en disco. Dentro del grupo que presentó un fenotipo resistente, se investigó la presencia de los determinantes tetK, tetL, tetM, tetO, tetW, otrA y otrB por PCR y se determinaron los valores de CIM para tetraciclina, oxitetraciclina y minociclina. De acuerdo con los resultados obtenidos por PCR, 23 aislamientos (77%) presentaron al menos un determinante de resistencia a tetraciclina o a oxitetraciclina; el genotipo tetK se encontró en 10 de esos aislamientos, mientras que los genotipos tetL, tetM y otrA se hallaron en 3, 2 y 5 aislamientos, respectivamente. Ningún aislamiento presentó los genotipos tetW, tetO ni otrB. Adicionalmente, se encontraron los genotipos tetK plus tetM (2 aislamientos); tetK plus tetL (1 aislamiento) y tetK plus otrA (1 aislamiento). Por otra parte, 7 cepas (23%) resultaron resistentes a tetraciclina, oxitetraciclina y/o minociclina por CIM, pero no presentaban ninguno de los determinantes tet u otr estudiados. Estos resultados indican la existencia de un alto porcentaje de cepas de B. cereus aisladas de miel con genes de resistencia a tetraciclina y oxitetraciclina, incluyendo los determinantes tetK, tetL, tetM y otrA. Este estudio constituye el primer registro de la presencia del determinante tetK de resistencia a tetraciclina en B. cereus, como así también la presencia del determinante otrA dentro del género Bacillus.



  • Evaluar alternativas no contaminantes para el control de loque americana a campo.

Se continuaron los estudios para evaluar la efectividad del empleo de biocidas alternativos de baja o nula residualidad en miel para el control de loque americana, lo cual permitirá mejorar la calidad de las mieles evitando la presencia en las mismas de residuos de antibióticos. En ese sentido se están investigando bacteriocinas producidas por especies que comparten el mismo habitat que P. larvae. Las bacteriocinas son péptidos bioactivos o complejos peptídicos que tienen efecto bactericida o bacterioestático sobre especies bacterianas estrechamente relacionadas, pero la célula productora es inmune a su propia bacteriocina.

6. Recopilación, análisis y difusión de datos epizootiológicos concernientes a la lucha internacional contra las enfermedades

Se completó y envió el cuestionario para laboratorios/proveedores de PEEC que procesan muestras de animales terrestres de acuerdo con lo solicitado oportunamente para la « Encuesta mundial sobre las Normas de Calidad para laboratorios y los programas de evaluación externa de la Calidad (PEEC) ».



7. Facilitación de pericia por expertos a la OIE o a los Miembros de la OIE

La experta de la OIE, A. M. Alippi efectuó las siguientes actividades durante el año 2009:



  1. Reviewer para Apidologie: Artículo evaluado: “Novel Lactic Acid Bacteria inhibiting Paenibacillus larvae in honey bee larvae” Ref. MN m09040, marzo de 2009.

  2. Evaluadora externa de un proyecto de investigación para la acreditación en el programa de incentivos año 2009. Secyt-Universidad Nacional de Catamarca, Argentina, marzo de 2009.

  3. Jurado de Tesis Doctoral, Carrera de Doctorado en Ciencia Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad del Centro de la Prov. de Bs. As. Tesista: Med. Vet. Juan Antonio Passucci – Tema: Factores de riesgo de loque americana en apiarios del partido de Tandil. Defensa: 13 de abril 2009.

  4. Reviewer para Apidologie: Artículo evaluado: “Can fatty acids and oxytetracycline protect artificially raised larvae from developing European foulbrood?” Ref. MN m09038, abril de 2009.

  5. Consultoría en el marco del Laboratorio de referencia de la OIE: Med. Vet. Fabiola Fernández S. Laboratorio de Fitoquimica, Universidad Austral de Chile (UACH), Chile. Asesoramiento en el tema: “Técnicas de cultivo para Paenibacillus larvae”, mayo de 2009.

  6. Consultoría en el marco del Laboratorio de referencia de la OIE: Dra. Sandra R. Quilodrán Vega, Laboratorio de Microbiología de Alimentos, Universidad de Concepción, Chile. Asesoramiento en los temas: Técnicas de detección de esporas de Paenibacillus larvae a partir de mieles y larvas contaminadas mediante técnicas microbiológicas clásicas y PCR” y “Aislamiento, cultivo e identificación de P. larvae”, en diversas oportunidades durante el año 2009..

  7. Reviewer para Applied Microbiology: Artículo evaluado: ”In vitro inhibition of Paenibacillus larvae, the American Foulbrood agent, by Lactobacillus johnsonii strains isolated from the intestinal tract of honeybees Apis mellifera L. LAM-2009-1041, junio de 2009.

  8. Reviewer para World Journal of Microbiology and Biotechnology: Artículo evaluado: Efficacy of indigenous plant essential oil Andean thyme (Acantholippia seriphioides A. Gray) to control American foulbrood (AFB) in honey bee (Apis mellifera L.) hives. WIBI 4835, junio de 2009.

  9. Reviewer para Journal of Apicultural Research incorporating Bee World. Artículo evaluado:Toxicity of Essential Oils and Other Natural Compounds to the Parasitic Mite, Varroa destructor, and to Larvae and Workers of the Honey Bee (Apis mellifera L.). JAR 0970NC, junio de 2009.

  10. Reviewer para World Journal of Microbiology and Biotechnology: Artículo evaluado: Antibacterial activity of copper and cobalt amino acids complexes. WIBI 5047, julio de 2009.

  11. Reviewer para Phyton Artículo evaluado: Actividad antibacteriana y antifúngica de la miel de Quillaja saponaria Molina, agosto de 2009.

  12. Reviewer para Apidologie. Artículo evaluado: Determination of the status of American foulbrood etiological agent, Paenibacillus larvae, in Swaziland using surveillance standards set by the World Organisation for Animal Health, MN No. M09070, agosto de 2009.

  13. Jurado de Tesina de grado, Licenciatura en Tecnología de alimentos, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP. Tesinista: María E. Rusconi. Tema: Efecto de prebióticos a base de bifidobacterias sobre la esporulación, germinación y producción de toxinas de Clostridium difficil. Defensa: 11 de septiembre de 2009.

  14. Reviewer para Revista de Medicina Veterinaria. Artículo evaluado: Prevalencia de enfermedades en abejas meliferas (Apis mellifera L.) en apiarios del sur de la provincia de Córdoba. MN No. 034-09, octubre de 2009.

Adicionalmente, A.M. Alippi continuó en sus funciones como:

  • Representante Regional (Argentina) del IBRA (International Bee Research Association), INGLATERRA.

  • Associate Editor: Journal of Apicultural Research, INGLATERRA. ISSN 0021-8839.

  • Council Member of the Internacional Bee Research Association (IBRA).

  • Miembro de la Comisión Asesora Honoraria de Agronomía. Comisión de Investigaciones Científicas de la Prov. de Buenos Aires (CIC), Argentina.

8. Suministro de formación científica y técnica al personal de otros Miembros de la OIE

La experta de la OIE, A.M. Alippi participó en la adecuación de métodos de diagnóstico para loque americana en diversos laboratorios.

Se recibió al personal técnico del laboratorio de Biología Molecular – Laboratorio Animal de SENASA de la localidad de Martínez, Buenos Aires, Argentina, el cual recibió asesoramiento en técnicas de puesta a punto de PCR específica para la detección de P. larvae en muestras de larvas y abejas adultas, como así también a partir de cultivo puro bacteriano.

Se colabora activamente con el Ministerio de Asuntos Agrarios y con el Ministerio de la Producción de la Prov. de Bs. As., Argentina a través de la Dirección provincial de ganadería y mercados, la Dirección provincial de Desarrollo Rural, el Departamento Animales Menores de Granja y sus servicios de extensión y fiscalización.

La experta de la OIE, A.M. Alippi es directora de los siguientes investigadores y becarios participando en la formación de recursos humanos en temas relacionados:


  1. Investigador Asistente CONICET. Dr. Francisco J. Reynaldi. Tema: Comportamiento cinético en colmenas de diferentes biocidas administrados vía digestiva en abejas adultas. En curso.

  2. Investigador Asistente CONICET. Dra. Ana Claudia López. Tema: Estudio de los factores de virulencia de cepas de Bacillus cereus y Bacillus megaterium aisladas de miel y sus mecanismos de resistencia a tetraciclina. En curso.

  3. Becaria Post-Doctoral CONICET (Argentina)N Dra. Andrea Toledo. Tema: Estudios in vitro e in vivo de las interacciones entre la microbiota asociada a la cutícula de Delfácidos y Cicadélidos ( Hemiptera: Auchenorryncha) y sus hongos patógenos. Desde el 1 de abril de 2007 hasta el 31 de marzo de 2009 inclusive.

  4. Becario de nivel Inicial, Ing. Forestal Ulises Ezequiel Paolo Acuña. Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT), 2008-2010. En el marco del proyecto PICT 2411. Tema: Estudio de los determinantes de resistencia a tetraciclina en bacterias esporuladas aeróbicas aisladas de miel. Desde el 1 de diciembre de 2008 hasta el 30 de junio de 2009.

  5. Directora de Tesina de Grado: Ignacio León. Tema: Caracterización del plásmido pPL374 presente en cepas de Paenibacillus larvae de alta resistencia a tetraciclina. Licenciatura en Biotecnología, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP. En curso.

  6. Becario de entrenamiento CIC, Sr. Ignacio León. Tema: Caracterización del plásmido pPL374 presente en cepas de Paenibacillus larvae de alta resistencia a tetraciclina. Desde el 1 de octubre de 2009 , en curso.

  7. Becaria de nivel superior, Dra. Jessica Minnaard. Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT), 2009-2010. En el marco del proyecto PICT 2411. Tema: Caracterización de sustancias antagónicas de origen bacteriano activas frente a Paenibacillus larvae y su potencialidad como herramienta de control biológico de loque americana de las abejas. Desde el 1 de octubre de 2009, en curso.

9. Suministro de servicios para las pruebas de diagnóstico a otros Miembros de la OIE

Ninguno durante 2009.



10. Organización de reuniones científicas internacionales en nombre de la OIE o de otros organismos internacionales

Ninguna durante 2009.



11. Participación en estudios científicos internacionales colaborativos

Se continúa colaborando con el SAG (Servicio Agrícola Ganadero) de Chile en relación a técnicas de detección e identificación de P. larvae.



12. Publicación y difusión de información concerniente al trabajo de la OIE (incluidas una lista de las publicaciones científicas, las actividades de publicación por internet, las presentaciones en conferencias internacionales).

  • Publicaciones científicas en revistas con examen por pares

López, A.C. & Alippi, A.M. Diversity of Bacillus megaterium isolates cultured from honeys.LWT - Food Science and Technology, 42: 212-219, 2009. ISSN: 0023-6438.

Reynaldi F.J., Albo G.N., Giusti M. & Alippi A.M. Determinación de la dosis óptima de tartrato de tilosina para el control a campo de la loque americana de las abejas. En prensa: Analecta Veterinaria, 2009.


López A.C. & Alippi A.M. Screening of virulence factors in Bacillus cereus and Bacillus megaterium isolates recovered from honeys. Enviado: Revista Argentina de Microbiología, 2009.


  • Otras comunicaciones

Se está redactando el Manual de Calidad de la UB-CIDEFI para lo concerniente a servicios a terceros dentro del marco del mandato de la OIE para el alcance de la Norma ISO 17025.

13. Inscripción de kits de diagnóstico en el Registro de la OIE

i) ¿Participó usted a grupos de expertos para asesorar kits candidatos a la inscripción en el Registro de la OIE? Si la respuesta es positiva, ¿cuáles reactivos fueron asesorados?

No

ii) ¿Presentó usted la candidatura de kits para inscripción al Registro de la OIE? Si la respuesta es positiva, ¿cuáles kits?



No

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Informes anuales de los Laboratorios de Referencia y Centros Colaboradores de la OIE, 2009


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