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INDICE GENERAL

DEDICATORIA

AGRADECIMIENTOS

RESUMEN


SUMMARY

INDICE GENERAL ……………………………………………… i

INDICE DE FIGURAS ........................................................................ v

INDICE DE TABLAS ........................................................................ vi

ANEXOS ......................................................................... vi

ABREVIATURAS .......................................................................... vii



1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………. 1

1.1. Generalidades ……………………………………………..... 1

1.2. Vibriosis en Chile ……………………………………………..... 2

1.3. La vibriosis ……………………………………………..... 3

1.3.1. Epizooetiología …………………………………………...….. 3

1.3.2. Signos clínicos ………………………………………………. 3

1.3.3. Histopatología ………………………………………………. 4

1.4. Reservorio y transmisión …………………………………….... 4

1.5. Listonella anguillarum y Vibrio ordalii: ……………………….......... 5

1.5.1. Posición taxonómica …………………………………….... 5

5.1.5.2. Caracterización bioquímica ……………………………………… 6

1.5.3. Caracterización serológica …………………………….………... 7



1.5.4. Caracterización genética ……………………………………… 9

1.6. Factores de virulencia ……………………………………… 10

1.7 Tratamiento y prevención ………………………………...……. 11

2. HIPÓTESIS ………………………………….....…..…….. 12

3. OBJETIVO GENERAL ……………………...…………....…. 12

3.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS ………………………………............ 12



4. MATERIALES ………………………………………..…….. 13

4.1. Aislados incluidos en este estudio. ……………………………. 13

4.2. Animales experimentales: …………………………………..…. 13

4.3. Enzimas ……………………………………………………… 13

4.4. Anticuerpos. ……………………………………………………… 14

4.5. Material fungible …………………………………………….... 14

4.5.1. Reactivos. ………………………………………………………. 14

5. METODOLOGÍA ……………………………………………… 15

5.1. Procesamiento de los aislados ……………………………………... 15

5.1.1. Muestreo ……………………………………………………..... 15

5.1.2. Medios y condiciones de cultivos ………………………….…. 15


5.1.3. Ensayos bioquímicos ……………………………………………... 15


5.1.4. Extracciones ……………………………………………………… 16

5.1.4.1. Extracción de ADN ……………………………………………… 16


5.1.4.2. Extracción de proteínas totales y membrana externa …………… 16

5.1.4.3. Extracción de lipopolisacáridos (LPS) ………………………... 17

5.1.4.4. Extracción de antígeno “O” de bacterias …..…………………. 18

5.2. Identificación Molecular …………………………………… 18

5.2.1. Análisis filogenético basado en el gen ARNr 16S …………. 18

5.2.1.1 Amplificación del gen ARNr 16S mediante partidores universales .. 18


5.2.1.2. Análisis de las secuencias …………………………………….... 19

5.2.2. Amplificación de la región intergénica (ITS) entre el 16S – 23S ARNr. 19

5.3. Caracterización Molecular ……………………………………… 20

5.3.1. Análisis de los aislados mediante electroforesis de campo pulsado…... 20

5.3.2. Análisis de restricción de los espaciadores intergénicos …………….. 21

5.3.3. Análisis de secuencias intergénicas repetitivas (PCR–ERIC)................ 22

5.3.4. Análisis de elementos extragénicos repetitivos (PCR-REP)…………. 22

5.3.5. Electroforesis en geles de agarosa …………………………….... 22

5.4. Caracterización serológica ………………………………………. 24


        1. Obtención de sueros ……………………………………………….. 24

5.4.1.1. Formulación del antígeno ……………………………………… 24

5.4.1.2. Inmunización de conejos ……………………………………… 24

5.4.1.3. Inmunización de peces ……………………………………… 24

5.4.1.4. Absorción de sueros ……………………………………… 25

5.4.2. Titulación de los sueros por ELISA ……………………………… 25

5.4.3. Ensayos de Aglutinación ……………………………………… 26

5.4.4. Ensayos de dot-blot ………………………………………………. 26

5.4.5. Revelado para dot-blot y western-blot ……………………………... 27

5.4.6. Ensayo de Western-blot ………………………………………. 27

5.5. Estudios de virulencia ………………………………………. 28



6. RESULTADOS ……………………………………………….. 29

6.1. Identificación de los aislados de vibriosis ……………………… 29

6.1.1. Análisis filogenético del gen ARNr 16S ……………………. 29

6.2. Caracterización genética ……………………………………... 32

6.2.1. Amplificación de ITS entre el gen ARNr 16S y el 23S …………….. 32

6.2.2. RFLP-ITS ………………………………………………………. 33

6.2.3. Electroforesis de campo pulsado (PFGE) …………………….. 33

6.2.4. Análisis de elementos extragénicos repetitivos (PCR-REP)................. 36

6.2.5. Análisis de secuencias intergénicas repetitivas (PCR-ERIC)………… 37

6.3. Caracterización molecular de componentes estructurales …………… 38

6.3.1. Proteínas totales y externas ………………………………………. 38

6.3.2. Lipopolisacáridos (LPS) …………………………………………… 40

6.3. Estudios serológicos de agentes causales de vibriosis ……………. 40

6.3.1. Obtención de sueros policlonales en conejos y su titulación por ELISA 41

6.3.2. Ensayo de aglutinación en porta-objeto …………………….. 42

6.3.3. Ensayos de Dot-blot ……………………………………… 43

6.3.4. Ensayos de Western-blot ……………………………………… 46

6.4. Estudios de virulencia ……………………………………… 51



7. DISCUSIÓN ……………………………………………… 52

7.1. Identificación …………………………………………..….. 52

7.2 Caracterización genética ……………………………………... 53

7.3. Caracterización de los componentes de la envoltura celular …… 56

7.4. Caracterización antigénica ……………………………………... 56

8. CONCLUSIÓN ……………………………………………… 59

9. REFERENCIAS ……………………………………………… 601

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Colonias típicas de los aislados chilenos de vibriosis …………….. 7

Figura 2. Comparación de las secuencias del gen ARNr 16S de aislados chile-

nos y aquellos disponibles para especies del género Vibrio..……..….. 30

Figura 3. Árbol filogenético a partir del gen ARNr 16S de aislados chilenos

causales de vibriosis en el sur de Chile .……………………...…..…. 31

F

igura 4. Análisis de los aislados mediante la técnica de PCR-ITS ……..….. 32



Figura 5. Patrón de PFGE y dendograma de aislados de vibriosis en Chile …. 34

Figura 6. Gel comparativo entre los patrones electroforéticos de PFGE de los

aislados de V. ordalii y L. anguillarum nacionales………………….. 35

Figura 7. Electroforesis de PCR-REP de los aislados de vibriosis estudiados.… 36

Figura 8. Perfil electroforético del producto de amplificación PCR-ERIC de

aislados de V. ordalii y L. anguillarum ……………………………..... 37

Figura 9 Electroforesis en SDS-PAGE de proteínas y dendograma para V.

ordalii……………………………………………………………………… 38

Figura 10. Electroforesis en SDS-PAGE de proteínas y dendograma para L.



anguillarum…………………………………………………………..…… 39

Figura 11. Perfiles electroforéticos de LPS de los aislados de vibiosis en Chile. 40

Figura 12. Gráfica de titulación por ELISA de sueros anti-L. anguillarum…… 42

Figura 13. Ensayo de dot-blot de los aislados chilenos de V. ordalii…………... 45

Figura 14. Ensayo de dot-blot de los aislados chilenos de L. anguillarum………. 45

Figura 15. Inmunoblot de proteínas de aislados chilenos de V. ordalii……. …... 47

Figura 16. Inmunoblot de proteínas de aislados chilenos de L. anguillarum ……. 48

Figura 17. Inmunoblot de lipopolisacáridos de aislados chilenos de V. ordalii…. 49

Figura 18. Inmunoblot de lipopolisacáridos de aislados chilenos de L. anguillarum 50

Figura 19. Mortalidad en los ensayos de virulencia ……………………………… 51

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Partidores utilizados en los estudios de caracterización genética……... 23

Tabla 2. Aislados representativos de L. anguillarum y V. ordalii seleccionados

para su caracterización serológica. ……………..……………….. 41

Tabla 3. Títulos obtenidos a partir de conejos inmunizados con los aislados seleccionados de V. ordalii y L. anguillarum …………………….. 41

Tabla 4. Ensayo de aglutinación en portaobjeto usando los antisueros de L.



anguillarum y V. ordalii para los aislados chilenos ..………………… 43

ANEXOS


Anexo 1: Principales características fenotípicas, fisiológicas y bioquímicas de las especies L. anguillarum y V. ordalii ……………………………..… 68

Anexo 2: Aislados bacterianos estudiados en la presente tesis, los cuales fueron asociados a mortalidades de salmónidos entre octubre 2004 y agosto2005..…. 69



ABREVIATURAS

-ME -mercaptoetanol

ADN ácido desoxirribonucléico

Ag O Antígeno O

ARNr: ARN (ácido ribonucleico) ribosomal

BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indol fosfato p-toloudin

BrEt bromuro de etidio

BSA seroalbúmina de bovino

CBB Coomassie Brilliant Blue

DMSO dimetilsulfóxido

DTT ditiotreitol

EDTA ácido etilen-diamino-tetra-acético

ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorbent Assay ) ensayo inmunoenzimático

ERIC secuencias consenso repetitivas intragénicas de enterobacterias.

h hora / horas

HRP peroxidasa de rábano

IgG inmunoglobulina tipo G

ITS (Internal Transcribed Spacer) espaciador entre genes ARNr 16S y 23S

kDa kilo Dalton

LPS lipopolisacárido

mA miliamper

NBT azul de nitrotetrazolium

NC nitrocelulosa

nM nanomolar

OPD o-fenilendiamina

PAGE electroforesis en Geles de Poliacrilamida

pb pares de bases

PBS tampón fosfato salino

PCR: (Polymerase Chain Reaction) Reacción en cadena de la polimerasa.

PFGE electroforesis de campo pulsado

PM peso molecular

PMSF fenil-metil-sulfonil-fluoruro

PSA persulfato de amonio

REP secuencias palindrómicas repetitivas extragénicas

RFLP polimorfismo del largo de los fragmentos de restricción

RNA ácido ribonucleico

rpm revoluciones por minuto

SDS dodecil sulfato de sodio

SRS síndrome rickettsial del salmón.

TA temperatura ambiente

TAE tampón tris, acetato, EDTA

TEMED N, N, N’, N’-tetrametil etilen diamina.

TCBS agar tiosulfato-citrato-sacarosa con sales biliares

Tris-HCl clorhidrato de Tris (hidroximetil) Aminometano

TSA medio de cultivo Agar tripticasa de soya

U unidades

V.p. Vibrio parahemolítico

V volts






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