Anticuerpos



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Anticuerpos



INDICE





INDICE 1

Introducción 3

Definición 3

Antígenos, antigenicidad e inmunogenicidad 4

Interacción antígeno-anticuerpo 4

Anticuerpos policlonales y monoclonales 4

Figura 2 6



Anticuerpos recombinantes 6

Anticuerpos quiméricos 8

Moléculas recombinantes derivadas de anticuerpos 9

Fragmentos de anticuerpos 9

Single chain Fv (scFv) 9

“Diabodies”, anticuerpos biespecíficos, “triabodies” y “minibodies” 10

Proteínas de fusión 11

Bibliografía 11



Introducción

Desde su descubrimiento, hacia finales del siglo pasado, los anticuerpos han cautivado la atención de médicos, bioquímicos y científicos en el área de las biociencias y la historia recoge testimonios de ello. Por ejemplo, el primer premio Nobel, otorgado en el área de Fisiología o Medicina, lo recibió Emil von Behring, precisamente, gracias al trabajo en el cual reportó el descubrimiento de los anticuerpos (4). Desde entonces y hasta el presente, quince premios Nobel han sido otorgados a individuos que han hecho aportes significativos en el ámbito de la inmunología. Siete de éstos fueron entregados a personas cuyo trabajo estuvo directamente relacionado con anticuerpos. Sin duda, este interés surgió de la inmensa potencialidad que, desde un inicio, les fue reconocida a estas moléculas para ser usadas en aplicaciones diagnósticas y terapéutico-profilácticas. Los anticuerpos policlonales, o antisueros, fueron los protagonistas en la época de la serología y la seroterapia. Los anticuerpos monoclonales, de primera generación, aparecieron a mediados de los años setenta para convertirse en las herramientas principales de poderosas técnicas analíticas como los radioinmunoensayos, los ensayos inmunoenzimáticos y la citometría de flujo. Más recientemente, avances importantes en el área de la biología molecular y el desarrollo de técnicas de ADN recombinante han hecho posible la creación de anticuerpos recombinantes, también llamados anticuerpos monoclonales de segunda generación.



Definición

Los anticuerpos son moléculas de peso molecular aproximado de 150 KDa, pertenecientes al grupo de las Inmunoglobulinas (Ig). Son moléculas capaces de reconocer otras moléculas, los antígenos. La capacidad de reconocimiento de un anticuerpo radica en las secuencias variables de sus cadenas proteicas, generadas por recombinación de una serie de “gen cassette” en el proceso de producción de linfocitos B durante el desarrollo embrionario. La combinatoria de estas secuencias puede producir más de un billón de secuencias diferentes.


La estructura básica de un anticuerpo se esquematiza en la figura 1; está formado por dos cadenas proteicas pesadas y dos ligeras, unidas por puentes disulfuro. Se dividen en varias clases que se identifican según el tipo de cadena pesada en: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE.


Figura 1


Los elementos estructurales de los anticuerpos que les permiten su funcionalidad son:



  • Fc: corresponde al extremo C-terminal de las dos cadenas pesadas. Este fragmento está constituido por la región constante de la cadena pesada y es característica de cada clase de inmunoglobulinas. Es en ésta región donde radican las funciones efectores de la molécula. La región Fc es característica de la especie.

  • Fab: corresponde al N-terminal de las cadenas pesadas y ligeras.



Antígenos, antigenicidad e inmunogenicidad

Virtualmente toda molécula ajena a un determinado organismo se comporta frente a éste como un antígeno, Se pueden diferenciar dos características primordiales en un antígeno. Por una parte la inmunogenicidad o capacidad que presenta una molécula para generar una respuesta inmune en un organismo dado y la antigenicidad o particularidad del antígeno que hace que éste sea reconocido por un determinado anticuerpo. Ambas propiedades pueden o no estar presentes en un determinado antígeno. Moléculas de pequeño tamaño (haptenos o péptidos) son poco inmunogénicas y por ello se asocian a proteínas transportadoras de alto peso molecular o 'carriers' para inducir una respuesta inmune adecuada.


A la región del antígeno reconocida por un anticuerpo se le denomina epítope o determinante antigénico. Un antígeno puede presentar un número variable de epítopes de estructura única o repetitiva. La complejidad estructural de las proteínas favorece que éstas presenten por lo general un número elevado de epítopes distintos, mientras que los ácidos nucleicos y los polisacáridos, dada su repetitividad estructural, poseen un número escaso de epítopes diferentes.

Interacción antígeno-anticuerpo

La interacción entre antígeno y anticuerpo se estabiliza mediante enlaces débiles, como puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Wals e interacciones electrostáticas e hidrofóbicas. La suma de todos estos enlaces genera una interacción estable entre el lugar de unión del anticuerpo (paratopo) y el lugar de unión del antígeno (epítope). Estas fuerzas son inversamente proporcionales a una potencia de la distancia entre los grupos interactuantes, lo que implica que epítope y paratopo deben presentar estructuras complementarias para obtener una energía de unión suficiente como para resistir la disrupción termodinámica. La suma de estas fuerzas de atracción y de repulsión se conoce como afinidad del anticuerpo.



Anticuerpos policlonales y monoclonales

Cuando se inmuniza un animal con un antígeno y se provoca una respuesta inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Ig específicas del antígeno empleado. Esto es la consecuencia de la selección clonal de los limfocitos B que producen anticuerpos contra el antígeno. Como hemos visto un antígeno puede presentar diferentes epítopos, y cada uno de ellos ser reconocido por un clon de linfocitos B que producirá moléculas Ig con una secuencia característica. Por ello en el suero de un animal inmunizado se acumulan un número desconocido, posiblemente elevado, de diferentes moléculas de Ig específicas en mayor o menor medida de nuestro antígeno. Se trata de un suero producido por la acción de síntesis de numerosos clones de linfocitos B y por ello se ha denominado policlonal.


El término anticuerpo monoclonal (AcMo) se usa para referirse a una población de moléculas de Ac (anticuerpos), todas idénticas, las cuales consecuentemente, poseen todas la misma especificidad. De lo anterior se desprende que, en una prueba analítica, el chance de obtener falsos positivos, es decir, "reconocer lo que no es como si lo fuera" es mucho menor cuando se usan reactivos monoclonales.
En 1975, en un trabajo que posteriormente les valió el premio Nobel, G. Kohler y C. Milstein demostraron la posibilidad de producir AcMo mediante la fusión de linfocitos B con células mielomatosas (células tumorales inmortales). Ellos demostraron que los híbridos resultantes de tal fusión heredan la capacidad para crecer indefinidamente en cultivo y para producir anticuerpos, y que, además, es posible aislar del producto heterogéneo de fusión aquellos híbridos secretores del anticuerpo en el cual se está interesado. Así nacieron los AcMo, posteriormente denominados de primera generación, para distinguirlos de los anticuerpos producidos mediante técnicas de biología molecular y ADN recombinante, que han sido llamados de segunda generación.

La técnica original descrita por Kohler y Milstein (Figura 2) permite la obtención de AcMo de ratón. De manera resumida, el proceso se inicia con la inmunización de ratones de laboratorio (cepa Balb/c) con el antígeno para el cual se desea producir los anticuerpos. Una vez que se tiene la certeza del status inmune de estos animales (por lo general esto se establece tomando muestras de sangre y examinando y/o cuantificando la presencia de anticuerpos específicos en el suero inmune), los mismos son sacrificados y se obtiene el bazo, en el cual se encuentra una población numerosa de linfocitos B. A continuación, los esplenocitos se fusionan con células mielomatosas inmortales que son mantenidas en el laboratorio en la forma de líneas celulares gracias a su capacidad para crecer indefinidamente en cultivo. La fusión, fenómeno poco común en células somáticas, es facilitada mediante la adición de agentes virales (virus Sendai), químicos (polietilenglicol) o físicos (electricidad), de los cuales el más usado es la sustancia química denominada polietilenglicol (PEG). El producto de la fusión entre un esplenocito y una célula mielomatosa es denominado hibridoma. Los hibridomas heredan características fenotípicas de ambas células parentales de manera tal que son capaces de crecer indefinidamente y de producir el anticuerpo codificado en los genes del esplenocito pariente. Obviamente, la población de hibridomas obtenida mediante una fusión, como la descrita anteriormente, es heterogénea en cuanto a los anticuerpos secretados por ella. Con el objeto de seleccionar los híbridos productores del anticuerpo de interés se realiza clonación celular. Esta clonación consiste en sembrar los hibridomas en microcultivos a una densidad celular tan baja que se garantiza que las células integrantes de la población obtenida en cada microcultivo sean todas idénticas, es decir, conformen un clon. Los anticuerpos secretados por estas poblaciones clonales de hibridomas son anticuerpos monoclonales. Utilizando un principio, similar al antes descrito, se han preparado reactivos monoclonales provenientes de otras especies, inclusive humanos.



Figura 2


Ahora bien, además de su altísima especificidad, es necesario reconocer otros dos atributos que han contribuido al éxito de los AcMo como reactivos analíticos. En primer lugar, los AcMo son sustancias químicamente bien definidas, su naturaleza y estructura se conoce en detalle y ello permite la formulación de preparaciones estables y facilita enormemente los procedimientos para su conjugación a trazadores tales como sustancias fluorescentes, enzimas, radioisótopos, oro coloidal, moléculas electrón-densas (ferritina), etc. En segundo lugar, son reactivos susceptibles de ser preparados en forma pura, en condiciones muy controladas y en grandes cantidades.

En lo concerniente a aplicaciones biomédicas, los AcMo de primera generación han desplazado de muchas aplicaciones a los anticuerpos policlonales, han permitido el desarrollo y avance de numerosas y nuevas pruebas diagnósticas y son, en la actualidad, los reactivos de elección para aplicaciones analíticas, tanto en el ámbito de lo médico-clínico como en distintas áreas de la investigación en biociencias. Lo anterior es cierto para todo aquello relacionado con pruebas de laboratorio "in vitro", tanto en clínica como en investigación.



Anticuerpos recombinantes

En la actualidad existe la tecnología necesaria para la producción de anticuerpos en ausencia de inmunización del animal. Es la denominada tecnología de los anticuerpos recombinantes.  Los recientes avances en la tecnología génica han facilitado en gran medida la manipulación genética, producción, identificación y conjugación de fragmentos de anticuerpos recombinantes, obteniéndose nuevos anticuerpos multivalentes y multiespecíficos.


Como se mencionó, los AcMo de segunda generación, o anticuerpos recombinantes (AcR), son moléculas producidas empleando técnicas de biología molecular y ADN recombinante. Dicho de otra manera, los AcR son generados a través de la inmortalización de los genes que codifican a la molécula de Ig, en lugar de inmortalizar la célula productora del Ac, como es el caso para los AcMo de primera generación.

La concepción, el diseño y la ingeniería de moléculas artificiales, basadas en Ig, se ha facilitado enormemente gracias a dos características de estas proteínas. A nivel genético, los genes estructurales que codifican las Ig se prestan para hacer el trabajo de biología molecular. Estos genes se organizan en la forma de exones discretos, los cuales corresponden a dominios completos en la proteína (Figura 2), encontrándose separados por regiones intrónicas. Resulta así, por ejemplo, relativamente fácil manipular las secuencias intrónicas para añadir cambios que permitan la introducción en el gen de nuevas secuencias en lugares específicos, seleccionados previamente, sin implicar riesgo alguno de alterar la secuencia codificadora presente en los exones. De igual manera, a nivel proteico, la organización estructural-funcional de las Ig en la forma de estos módulos discretos, llamados dominios, en donde se encuentra almacenada la información necesaria para realizar una función específica, ha facilitado enormemente el logro de estos objetivos. Sin embargo, un elemento adicional, que no se puede dejar de mencionar y que ha tenido un impacto tremendo en el desarrollo de los AcR, lo constituyen, sin lugar a dudas, los avances ocurridos en el campo de la biología molecular, especialmente en lo relacionado con el desarrollo de métodos para la creación de moléculas de ADN recombinante basados en la reacción en cadena de polimerasa (PCR).

de esta forma, es posible clonar regiones responsables de una especificidad de interés y ensamblarla en la forma de un anticuerpo funcional en el contexto de, prácticamente, cualquier clase o subclase de IG humana.

Los AcR constituyen, entonces, un conjunto bastante heterogéneo de proteínas artificiales en el que se pueden distinguir dos grandes grupos. El primero incluye moléculas completas de Ac, similares a las conseguidas en forma natural, en las cuales están presentes los dos elementos estructurales, permitiendo así la funcionalidad de la molécula; esto es, las porciones Fab y Fc (Figura 2a). Los Ac quiméricos y humanizados son ejemplos representativos de este grupo. El otro grupo está formado por un conjunto más heterogéneo de proteínas noveles, basadas en la estructura de las Ig. Éstas pueden encontrarse en la forma de entidades recombinantes autónomas (fragmentos tipo Fab, Fv de cadena sencilla -scFv-, "diabodies", "triabodies", etc.), o como proteínas de fusión (moléculas en las que se combina la porción Fc o Fab con propiedades nuevas provistas por una toxina, una enzima, un receptor celular, una citoquina, etc.).

Anticuerpos quiméricos

Un anticuerpo quimérico (AcQ) es una molécula artificial en la cual, las porciones constantes de las cadenas pesada y liviana provienen de una Ig humana y las regiones variables VH y VL son obtenidas de un AcMo múrido (Figura 5). El objetivo perseguido con la construcción de un AcQ es reducir la inmunogenicidad para el humano de los AcMo de ratón o rata, pero sin afectar la especificidad del Ac. Es conocido que las porciones más inmunogénicas de la molécula de Ig están asociadas a la porción constante de la molécula, en particular a la región Fc. Al reemplazar estas regiones por las equivalentes de origen humano se busca que la molécula resultante sea menos "extraña" para los seres humanos y así facilitar su uso in vivo para la profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas (Figura 5). Adicionalmente, ya que la fisiología, catabolismo y las funciones efectoras de un Ac están asociadas al fragmento Fc, los AcQ debieran comportarse en forma óptima al ser administrados en humanos.




La técnica de "quimerización" fue desarrollada por Morrison y col. y Boulliane a mediados de los años 80. El procedimiento implica la clonación de los genes VH y VL múridos y la inserción de los genes clonados en vectores de expresión eucariota a los que, previamente, se ha incorporado los genes codificadores de la porción constante de las cadenas pesada y liviana humanas. Estos vectores son finalmente transfectados en forma estable en una línea celular seleccionada. La clonación de los genes VH y VL se realiza mediante RT-PCR (Figura 5) utilizando como molde ARN total o ARN mensajero (ARNm) obtenido de un hibridoma secretor de la especificidad de interés y oligonucleótidos complementarios a los extremos 3’ y 5’ de cada gen como iniciadores.

Una serie de vectores tipo "cassette" están disponibles donde los genes V pueden ser fácilmente clonados en el contexto de cualquier isotipo de cadena liviana y pesada humana. De forma similar, avances en el campo de la tecnología de transferencia de genes también han facilitado, y hecho más eficiente, el proceso de inserción de ADN foráneo en diferentes líneas celulares eucariotas.

En distintos trabajos, se ha demostrado, que los AcQ, ensamblados apropiadamente, son capaces de reconocer y ligar el antígeno y median, eficientemente, funciones efectoras como activación de complemento y reconocimiento de receptores Fc. Más aún, al compararse con los monoclonales equivalentes, se pudo documentar una reducción de la inmunogenicidad.

Moléculas recombinantes derivadas de anticuerpos

Hasta este punto, hemos tratado la producción de moléculas completas de anticuerpos recombinantes. Adicionalmente, la biología molecular ha sido utilizada para desarrollar moléculas noveles, basadas en la estructura de Ac, ya sea como entidades recombinantes autónomas o como proteínas de fusión. A continuación, revisaremos los ejemplos más significativos de este tipo de moléculas, las maneras como ellas fueron creadas y sus aplicaciones potenciales.



Fragmentos de anticuerpos

Mientras la expresión de AcQ se logra más fácilmente en hospedadores eucariotas, tales como células de mamífero o de plantas, la bacteria es el huésped preferido para la producción de fragmentos recombinantes de Ac. En virtud de las ventajas indiscutibles que ofrece en cuanto a manipulación, transformación, cinética de crecimiento y condiciones de fermentación, E. coli es en la actualidad el sistema de expresión más accesible y amigable para la producción de fragmentos de Ac.

Existen dos tipos de fragmentos con la capacidad de combinarse al antígeno, éstos son el Fv y el Fab (Figura 2A). Versiones funcionales de Fv y Fab fueron producidos en forma recombinante, por vez primera, en E. coli en 1988. Estos trabajos marcaron un hito en la producción de AcR, pues en ellos se demostró que la expresión en el espacio periplásmico de la bacteria permite la obtención, en forma relativamente sencilla, de moléculas de Ac completamente funcionales y con un alto rendimiento. Hasta ese momento, la mayor parte de los intentos persiguieron la expresión intra-citoplasmática, enfrentándose al problema del microambiente intracelular de la bacteria, el cual no es apropiado para el procesamiento post-traducción (plegamiento, formación de puentes disulfuro y glicosilación de las cadenas polipeptídicas nacientes). Esto trae como consecuencia la formación de cuerpos de inclusión en el citoplasma de la bacteria que contienen la proteína en una forma no funcional y de los cuales la recuperación es bastante ineficiente. La expresión de fragmentos de Ac en el periplasma de la bacteria, por el contrario, sigue una vía de ensamblaje similar a la que ocurre durante la producción de Ac convencionales en el retículo endoplásmico de una célula B. Ello permite producir moléculas activas en un pequeño volumen y en un compartimiento subcelular, el cual está relativamente libre de enzimas proteolíticas activas.


Single chain Fv (scFv)

1988 fue un año importante para la producción de AcR, no sólo por la aparición de los trabajos en los que se describió la expresión periplásmica como una vía eficiente para la producción de AcR en bacterias. Dos artículos fueron publicados ese mismo año en los cuales se reportó la producción en E. coli de una versión recombinante del fragmento Fv en la que los dominios VH y VL se encontraban unidos físicamente a través de un "linker" peptídico, pequeño y flexible. Este "linker" (~ 15 aminoácidos) tiene la longitud y flexibilidad necesarias para permitir el arreglo espacial adecuado de los dominios VH y VL, generándose un Fv funcional (Figura 6B). Tales construcciones fueron denominadas Fv de cadena sencilla (del inglés single chain Fv, scFv), son más estables, en comparación con el Fv convencional, y conservan la capacidad de reconocer y ligar anfígenos. Posteriormente, scFv han sido expresados en otros hospedadores además de E. coli, como la levadura P. pastoris, hongos filamentosos, células de insecto y células de mamífero, convirtiéndose en uno de los formatos preferidos para producir fragmentos recombinantes de Ac con capacidad para ligar antígenos, para preparar proteínas de fusión en las que se desea especificidad antigénica y para construir genotecas de Ac.




“Diabodies”, anticuerpos biespecíficos, “triabodies” y “minibodies”

Como se trata de moléculas que poseen un solo sitio de combinación al antígeno (monovalentes), los fragmentos Fab y scFv pudieran ser de uso limitado para ciertas aplicaciones en las cuales se requiere una afinidad elevada. Versiones multivalentes de estos fragmentos debieran presentar una afinidad funcional o avidez mayor. Además, AcR que combinen dos especificidades distintas lucen particularmente atractivos para ciertas aplicaciones como inmunodiagnóstico e inmunoterapia. Diversas estrategias han sido evaluadas para producir dímeros o polímeros de AcR. En muchas de ellas se utiliza el entrecruzamiento por medios químicos de dos fragmentos individuales, anteriormente, preparados y purificados por separado. Esto tiene obvios problemas en cuanto a rendimiento, purificación del fragmento deseado y cantidad de tiempo y trabajo empleado.


Una estrategia más efectiva, basada en técnicas de ADN recombinante, ha sido desarrollada. Esta estrategia se basa en la construcción scFv, sólo que la longitud del "linker" es menor en comparación la del scFv original. Esta reducción del "linker" (a tan solo 5 aminoácidos) imposibilita la formación de un Fv funcional entre dos dominios VH y VL en una misma molécula. Ello conduce a la interacción de dos moléculas de scFv , formándose un dímero, el cual posee dos sitios de combinación con el antígeno (Figura 6B). Si la especificidad de los dominios VH y VL es la misma, el producto obtenido es un homodímero bivalente conocido como "diabody" (la traducción más apropiada de "diabody" pudiera ser "fragmento bivalente").
Ahora bien, utilizando el mismo formato, es posible producir moléculas recombinantes con dos especificidades diferentes. Por ejemplo, si se desea combinar en una misma molécula las especificidades A y B de dos anticuerpos diferentes, se diseñan dos construcciones tipo scFv. Una de ellas tendrá la forma VHA-VLB y la otra VHB-VLA (ambas pueden encontrarse en el mismo vector). En forma similar a como ocurre con los "diabodies", los polipéptidos producidos a partir de estas construcciones son incapaces de formar scFv funcionales de manera individual. No obstante, sí son capaces de aparearse apropiadamente para generar heterodímeros en donde ambas especificidades A y B son restauradas y se encuentran físicamente asociadas (Figura 6B). Estas moléculas artificiales han sido bautizadas con el nombre de anticuerpos biespecíficos.

Si el péptido que sirve de "linker" entre los dominios VH y VL es eliminado completamente y ambas regiones son expresadas como un polipéptido continuo, entonces, el resultado es la formación de un trímero funcional con capacidad para ligar tres determinantes antigénicos (Figura 6B). A estos fragmentos se les ha designado "triabodies". De manera análoga al "diabody", quizás la mejor traducción de "triabody" sea "fragmento trivalente".


Los "minibodies" constituyen un caso interesante en el que dos grupos de moléculas artificiales, completamente diferentes, han sido designados con el mismo nombre. En 1994, Tramontano y col. describieron el diseño de un polipéptido artificial cuya estructura se basa en el dominio V de Ig ), al cual bautizaron "minibody". Este péptido tiene una longitud de 61 residuos de aminoácido, adopta una conformación tipo hoja beta plegada con dos asas que corresponden a regiones hipervariables y exhibe capacidad para ligar determinantes antigénicos. Además, retiene otras características deseables del dominio V de la molécula de Ac, como tolerancia a variabilidad de la secuencia en regiones específicas de la proteína y, en consecuencia, la capacidad para "evolucionar".




Proteínas de fusión

La tecnología de ADN recombinante ha hecho posible la concepción, diseño y elaboración de moléculas artificiales llamadas proteínas de fusión, en las cuales, motivos estructurales y/o funcionales, provenientes de dos o más proteínas naturales, son combinados. Varias características hacen a la molécula de Ac un candidato ideal para la elaboración de proteínas de fusión. En primer lugar, su diversidad y exquisita especificidad es deseable para la detección de un número virtualmente ilimitado de moléculas "target" con un riesgo marginal de reacciones cruzadas o no específicas. En segundo lugar, sus propiedades biológicas son atractivas para ciertas aplicaciones en las que se requieren moléculas recombinantes con propiedades específicas tales como vida media, talla y funciones efectoras. Finalmente, la organización modular de los anticuerpos, y los genes que los codifican, facilita grandemente el diseño y elaboración de moléculas recombinantes híbridas.



De esta manera, no sorprende que exista un importante número de proteínas de fusión donde se combinan porciones de moléculas de Ac diferentes, o con toxinas, interleuquinas, moléculas de adhesión, componentes de la matriz extracelular, hormonas, factores de crecimiento, etc.


Bibliografía





  • www.ub.es/biocel/wbc/tcnicas/anticuerpos

  • caibco.ucv.vital.vital Siet/Articulos/inmunologia/ArchivosHTML/SegGener.htm







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