Código: 5008312 Programa de Teoría tema 1: Introducción



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ASIGNATURA: Química Física de macromoléculas biológicas

CURSO 2003-2004

Código: 5008312
Programa de Teoría
TEMA 1: Introducción. Introducción histórica de la Química Física Biológica. Objeto y metodología de la Química Física Biológica.

TEMA 2 : Fuerzas intermoleculares en macromoléculas biológicas

Interacciones de Van der Waals. Interacciones electrostáticas. Enlace de hidrógeno.

El agua y las interacciones hidrofóbicas.

TEMA 3: Estructura de proteínas

Propiedades químico físicas de los aminoácidos. El enlace peptídico. Estructura de las proteínas.



TEMA 4 : Estructura de los ácidos nucleicos

Propiedades químico físicas de los nucleótidos. Estructura de los ácidos nucleicos.



TEMA 5 : Estructura de las membranas biológicas

Propiedades químico físicas de los lípidos. Modelos estructurales de biomembranas. Estructura de las proteínas de membrana.



TEMA 6: Termodinámica de las disoluciones de macromoléculas

Características de las disoluciones de macromoléculas biológicas. Entropía conformacional de mezcla. Teoría de Flory – Huggins y de Flory - Krigbaum.



TEMA 7 : Estadística conformacional de macromoléculas

Introducción al análisis conformacional. Dimensiones del ovillo estadístico. Modelos.



TEMA 8: Equilibrio conformacional en proteínas y ácidos nucleicos.

Introducción. Modelos. Plegamiento reversible de proteínas. Cambios conformacionales en el ADN natural.



TEMA 9: Equilibrio macromolécula – ligando.

Conceptos básicos. Unión a sitios iguales e independientes. Unión a sitios distintos e independientes. Cooperatividad y modelos alostéricos



TEMA 10: Termodinámica de procesos irreversibles.

Introducción. Flujos, fuerzas y producción de entropía. Ecuaciones constitutivas. Coeficiente fenomenológicos. Relaciones de Onsager. Estados estacionarios : El principio de mínima producción de entropía



TEMA 11 : Las macromoléculas biológicas como partículas hidrodinámicas. Métodos hidrodinámicos.

Volúmenes macromoleculares e hidratación. Coeficientes de fricción y forma de la macromolécula. Difusión. Sedimentación. Viscosidad. Electroforesis.



TEMA 12: Espectroscopia

Espectroscopía de absorción ultravioleta – visible. Fluorescencia. Espectroscopia infrarroja. Discroismo circular y dispersión óptica rotatoria. Dispersión elástica de la luz. Microscopía electrónica. Difracción de Rayos X. Resonancia magnética nuclear.



PRACTICAS

Práctica 1: METODOLOGIA BASICA. Manipulación de muestras biológicas en el laboratorio para estudios de tipo químico físico. Introducción básica a técnicas como : diálisis, cromatografía de exclusión molecular, concentración de las muestras de macromolécula, centrifugación, y medidas de la concentración de proteínas y ácidos nucleicos.

Práctica 2: VISUALIZACIÓN DE LA DESNATURALIZACION DE UNA PROTEINA. En esta proteína se determinará la diferente accesibilidad al medio de los aminoácidos de una proteína en estado nativo y desnaturalizado. Para ello se determinará el número de grupos sulfhidrilo expuestos al medio en las dos conformaciones. Para realizar la práctica se utilizarán la glucógeno fosforilasa de músculo, que se encuentra disponible comercialmente. La enzima contiene 9 grupos sulfhidrilo de los cuales cuatros son accesibles al medio en su estado nativo. Para desnaturalizar la proteína se utilizará el detergente lauril sulfato sódico (SDS) y para la determinación de los grupos sulfhidrilo el reactivo de Ellman (DTNB). El contenido básico de esta práctica se encuentra publicado en: “Visualitation of protein denaturation by chemical modification of sulfhydryl groups” Parody-Morreale A. and Barón, C. Journal of Chemical Education, Vol 63, 1003-4, 1986.

Práctica 3: CRISTALIZACIÓN DE PROTEINAS PARA LA DETERMINACIÓN DE SU ESTRUCTURA MEDIANTE DIFRACCIÓN DE RAYOS X. En esta práctica se llevará a cabo la cristalización de varias proteínas mediante los métodos más usuales en la cristalización de macromoléculas biológicas. A partir de datos experimentales reales del patrón de difracción de la lisozima se llevará a cabo una simulación del proceso de determinación de la estructura de esta proteína mediante la técnica de reemplazamiento molecular. Se utilizarán bases de datos de estructuras de macromoléculas biológicas.

Práctica 4: MEDIDA DE LA CONSTANTE DE UNION DE UN LIGANDO A UNA PROTEINA. Para esta práctica utilizaremos la proteína aspartato - glutamato transaminasa (GOT) y como ligando el succinato y el cloruro. Estos ligandos no son el sustrato de la proteína sino que se trata de un inhibidor y un anión que se unen al sitio catalítico de la enzima. En este se encuentra también localizado el cofactor fosfato de pidiroxal (PLP), el cual presenta un espectro UV-visible característico que depende del pH. Así, el PLP unido a la enzima presenta un máximo de absorción en pHs ácidos a 430nm, y de 360nm en pHs básicos. Estos cambios en función del pH se atribuyen a la protonación del grupo amino que aparece en la base de Schiff enzima - PLP, que presenta un pK de 5,4. Pero este pK se ve afectado por la presencia en el sitio activo de cloruros (pK=6,3) y succinato (pK=8,1). Si llevamos a cabo la adición de ión succinato a una disolución de enzima de pH 7,2 con una concentración constante de cloruros, podremos seguir espectrofotométricamente la unión del succinato midiendo el aumento de absorbancia a 430nm. Esta práctica está basada en la publicada en: “Spectrophotometric Determination of the Binding Constants of Succinate and Chloride to Glutamic Oxalacetic Transaminase” Parody-Morreale A, Camara-Artigas A. And Sánchez-Ruiz JM, Journal of Chemical Education, Vol 67, 988-990, 1990.

Práctica 5: DESNATURALIZACION DE PROTEINAS EN PRESENCIA DE AGENTES QUÍMICOS. En esta práctica utilizaremos la fluorescencia como técnica para seguir la desnaturalización de una proteína, la lisozima, en presencia de una agente desnaturalizante químico, el cloruro de guanidinio. Para realizar esta práctica se prepararan muestras que contengan la misma concentración final de proteína (aproximadamente de 20 g/mL) y distintas concentraciones de cloruro de guanidinio en el intervalo de 0 a 5 M en un tampón acético - acetato sódico 50 mM a pH 5. Las muestras se dejaran incubando a temperatura ambiente durante 24 horas, tras las cuales se procede a la medida de la intensidad de fluorescencia característica de los triptofanos presentes en las proteínas. Para la excitación utilizaremos una longitud de onda de 280 nm y se registrará el espectro de emisión de fluorescencia en el intervalo 300-450 nm. De la variación de la intensidad de fluorescencia a 350 nm se calcula la fracción de proteína desnaturalizada en función de la concentración de agente desnaturalizante. El análisis de estos datos nos permite obtener la constante de equilibrio y el cambio de energía libre de Gibbs para el proceso de desnaturalización. Los datos obtenidos se compararan con los de la bibliografía. La práctica esta diseñada con los datos publicados en: “A Model-Independent, Nonlinear Extrapolation Procedure for the Characterization of Protein Folding from Solvent-Denaturation Data” Ibarra-Molero B. And Sánchez-Ruiz J.M., Vol 35, 14689-14702; “Are There Equilibrium Intermediate States in the Urea-Induced Unfolding of Hen Egg-White Lysozyme? ” Ibarra-Molero B. And Sánchez-Ruiz J.M., Vol 36, 9616-9624.

Práctica 6: CATÁLISIS ENZIMÁTICA. ENZIMAS ALOSTÉRICAS Y MODULADAS COVALENTEMENTE. MODELO DE MWC. En esta práctica se utiliza una enzima regulada alostéricamente y covalentemente, la glucógeno fosforilasa, que se ha utilizado como modelo clásico para explicar tanto un tipo como otro de regulación. Esta enzima presenta regulación alostérica por parte del AMP (5’adenosin monofosfato) y covalente por fosforilación de un resto serina, catalizada por la enzima fosforilasa quinasa. Se realizan ensayos de actividad con la forma b de la enzima, que es la no fosforilada y por tanto no es activa per se, a varias concentraciones de sustrato (Glucosa-1-Fosfato) y de activador AMP. Para la interpretación de los resultados se aplicará el modelo de Monod-Wyman-Changeaux. Tesis doctoral de Ana Cámara-Artigas, Universidad de Granada.
BIBLIOGRAFÍA

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