Clase 23: Ingeniería metabólica Factores relevantes en ingeniería metabólica



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Agrobiotecnología.
Clase 23: Ingeniería metabólica

Factores relevantes en ingeniería metabólica
Transparencias 3-6
Para poder encarar un desarrollo en la ingeniería metabólica es necesario conocer las rutas metabólicas involucradas, la regulación de las enzimas implicadas, la disponibilidad de sustratos y las afinidades enzimáticas para con los mismos, los efectos fisiológicos que se producen al alterar un vía, los efectos producidos por la compartimentación subcelular de los productos y los efectos de su expresión en determinados tejidos u órganos.
La ingeniería genética dispone hoy de varias estrategias para modificar rutas metabólicas (transparencias 5 y 6). Básicamente, éstas permiten efectuar procesos tales como: a) completar rutas metabólicas mediante inserción de genes heterólogos; b) amplificar rutas normales; c) bloquear rutas alternativas; d) bloquear rutas normales; e) modificar la regulación de rutas normales; f) minimizar la aparición de respuestas en cascada. Las técnicas disponibles permiten prolongar, ramificar y bloquear rutas metabólicas. El flujo metabólico puede también incrementarse por expresión constitutiva de enzimas clave o por neutralización de los mecanismos de retroalimentación por acumulación de producto. Alternativamente, el flujo a través de una ruta determinada puede incrementarse por sobrexpresión de los factores de transcripción que intervienen en la regulación de la misma.

Modificaciones en las rutas de síntesis de hidratos de carbono
Transparencias 7-22
Los hidratos de carbono son utilizados para la obtención de una gran diversidad de productos en distintas ramas industriales. La transparencia 7 enumera algunos ejemplos de estos productos. La tabla inferior muestra los valores globales de la producción estimada de los principales carbohidratos. La transparencia 8 resume las principales áreas de trabajo en que se ha concentrado la investigación en este campo
El almidón está formado por dos polímeros distintos, la amilosa y la amilopectina (transparencia 9). La amilosa es un polisacárido no ramificado de unos 1.000 residuos de glucosa. En cambio, las moléculas de amilopectina poseen cadenas líneales y ramificaciones (aproximadamente, una cada 20 residuos de glucosa) y comprenden de 104 a 105 residuos de glucosa. Existen dos clases de enzimas que intervienen en la síntesis del almidón. Las que realizan uniones a(1®4) pueden estar bajo una forma soluble (sintetasa soluble del almidón; SSS) localizada en el estroma de los amiloplastos, bajo una forma unida a los gránulos de almidón (sintetasa unida al gránulo del almidón; GBSS). La enzima que produce uniones a(1®6) realiza las ramificaciones de la amilopectina (enzima ramificante del almidón; BE) y está también localizada en los amiloplastos. La proporción de amilosa en el almidón varía normalmente entre 20 y 30%, y la de amilopectina entre 70 y 80%. Las diferentes proporciones entre ambos componentes determinan las diferentes propiedades fisicoquímicas de los almidones. En la imagen inferior de la transparencia 9 se muestran las estructuras de los gránulos de almidón de maíz, papa y mandioca. A pesar de que el almidón se produce por la misma ruta metabólica en las tres plantas, la forma y las características de los gránulos de almidón son específicas para cada especie.
El uso del almidón depende de la estructura de los gránulos, así como también en su composición de amilosa, amilopectina y otros componentes menores (lípidos, proteínas y fosfatos). La relación entre amilosa y amilopectina, y la distribución de los glucanos de bajo peso molecular afectan propiedades tales como la temperatura de gelatinización, la retrogradación y la viscosidad. Los almidones con más del 90% de amilosa son más adecuados para la producción de películas. Para la confección de adhesivos se utilizan almidones con distintas proporciones de amilosa y amilopectina, dependiendo de las aplicaciones específicas. Las aplicaciones industriales del almidón dependen de su composición química particular, lo cual está principalmente determinado por el genotipo del cultivo de origen. Los programas de cruzamiento para alterar la composición del almidón resultan frecuentemente en líneas con rendimientos agronómicos reducidos, por lo que son poco competitivas en el mercado. Por esta razón, existe gran interés en explorar las posibilidades de mejoramiento de la calidad del almidón por técnicas de ingeniería genética.
La transparencia 11 muestra un esquema de las rutas de síntesis y degradación de algunos hidratos de carbono. La sobrexpresión o la supresión de los genes que participan de esta vía permiten favorecer la formación de algunos productos con decrecimiento de otros. Por ejemplo, cuando se disminuye la expresión de la enzima ramificante del almidón (BE), se produce almidón con un mayor contenido de amilosa. El incremento en la acumulación de almidón puede lograrse sobrexpresando enzimas heterólogas que no son reguladas por los mecanismos endógenos de la planta. Para modificar el balance amilosa/amilopectina, se puede reducir la expresión de las enzimas involucradas expresando transcriptos antisentido o induciendo el silenciamiento génico postranscripcional del gen correspondiente.
En las transparencias 12 y 13 se muestran los resultados de un trabajo en que se expresó un gen mutado de ADP-glucosa pirofosforilasa de Escherichia coli (gen glgC16) en S. tuberosum. Las ADP-glucosa pirofosforilasas vegetales están compuestas por tetrámeros. La fructosa 1,6-bifosfato y el Pi actúan como efectores positivo y negativo, respectivamente, de esta enzima. La enzima de E. coli es monomérica y no responde a los efectores que actúan en el tejido vegetal. Debido a que en las plantas la biosíntesis de almidón ocurre en los cloroplastos, se agregó una secuencia que codifica un péptido señal de transporte a cloroplasto (CPT) a la construcción utilizada para la transformación. La secuencia se puso bajo el control del promotor de 35S de CaMV. La enzima transgénica se procesó correctamente y resultó activa en las células vegetales. Se transformaron plantas de Lycopersicon esculentum, N. tabacum y S. tuberosum vía Agrobacterium tumefaciens. En el caso de Solanum, se utilizó el promotor del gen de patatina, el que se expresa en forma específica en los tubérculos. La transparencia 13 muestra el contenido de almidón en extractos de callos de tabaco transformados con el gen glgC16.. Las líneas 1 a 6 expresan el transgen; la línea 13 corresponde a una planta control no transformada. En una de las líneas transgénicas se llegó a obtener 26,9% de almidón mientras que en plantas controles el nivel fue de 3,4%. En la tabla, se muestran el incremento de la gravedad específica promedio y del contenido de almidón en tubérculos transgénicos. Como puede observarse, los tubérculos de las líneas transgénicas contienen un 35% más de almidón que en controles.
Las transparencias 14 y 15 muestran un ejemplo de modificación de la composición del almidón. El almidón de alta amilosa tiene gran demanda industrial por sus propiedades funcionales y existen pocos cultivos que lo producen naturalmente. Por esta razón, se transformaron plantas de S. tuberosum con una secuencia antisentido del gen de la enzima ramificante del almidón obtenida de esta especie. Se comprobó la casi total inhibición de las dos isoformas de la enzima (codificadas por los genes sbe A y sbe B). La morfología de la planta no resultó alterada; en cambio, los tubérculos adquirieron una morfología más alargada. El nivel de Pi en el almidón se incrementó en más de 5 veces. La inhibición simultánea de SBE A y SBE B afectó la estructura del almidón, así como también a la de los gránulos. Los gránulos de almidón de las plantas controles fueron ovalados, con bordes suaves, y mostraron birrefringencia bajo la luz polarizada, un indicador de ordenamiento cristalino (A). La mayoría de los gránulos de las líneas de alta amilosa exhibieron menos birrefringencia, lo que indicaba una reducción en la estructura cristalina, y poseían bordes irregulares con fisuras profundas en el centro del gránulo (B). Los cambios en la estructura y composición granulares condujeron a alteraciones en las propiedades del almidón. Los gránulos de almidón control comenzaban a hincharse a 70oC y formaron una pasta viscosa después de alcanzar los 95oC (C). Los gránulos de alta amilosa mostraron un incremento en la temperatura de empastamiento acorde a sus niveles de amilosa, pero la hinchazón del granulo resultó completamente inhibida cuando este nivel fue mayor del 55% (D).
La transparencia 16 muestra las rutas de biosíntesis que conducen a la formación de distintos hidratos de carbono. Las rutas normales de las células vegetales se esquematizan mediante flechas negras, mientras que aquellas modificadas por la introducción de genes de otros organismos se esquematizan con flechas rojas. La sacarosa es sintetizada vía UDP-glucosa a partir del depósito de hexosas-fosfato en el citoplasma y almacenada en la vacuola. En este compartimiento, puede ser transformada en fructanos por introducción de levano-sacarasas o fructosil-transferasas de distinto origen. La UDP-glucosa y la glucosa 6-fosfato pueden ser utilizadas como precursores para formar trehalosa por transformación de la planta con trehalosa sintetasas de otras plantas, hongos, insectos, etc. La glucosa 6-fosfato puede usarse también como precursor de azúcares-alcoholes (manitol, pinitol) mediante la transformación con enzimas apropiadas. En las hojas, la triosa-fosfato es transportada al interior de los cloroplastos, donde es convertida a hexosas-fosfato y luego a ADP-glucosa para la síntesis del almidón. Las ciclodextrinas no se producen en las plantas, pero el almidón puede ser usado como sustrato por algunas enzimas bacterianas involucradas en su síntesis.
Existen muchos hidratos de carbono de interés comercial que son producidos sólo por algunas plantas (manitol, pinitol) y/o por microorganismos (fructanos, ciclodextrinas). Los compuestos que se refieren en la transparencia 17 han sido sobrexpresados en plantas modelo y/o cultivos agronómicos por técnicas de ingeniería genética. Como el almidón y la sacarosa, los fructanos están naturalmente presentes como reserva de carbohidratos en muchas plantas (algunas de las cuales comemos). Los fructanos, o polifructosilsacarosas, son polímeros de fructosa que derivan de la sacarosa. Los fructanos son producidos por alrededor del 15% de las especies de plantas con flores, como también por bacterias y hongos. En las pasturas, los fructanos son almacenados principalmente en la bases de las hojas y usados para el rebrote luego de la defoliación, mientras que el almidón es almacenado en semillas. En contraste con el almidón, el que es almacenado en organelas especializados (plástidos), los fructanos son sintetizados y almacenados en las vacuolas de las células vegetales. En otras plantas, los fructanos se almacenan en órganos especializados, como por ejemplo en la raíz principal de achicoria (Cichorium intybus), en los tubérculos de dalia (Dahlia variabilis), y en los bulbos del tulipán (Tulipa gesneriana) y de la cebolla (Allium cepa).
La transparencia 18 muestra un ejemplo de expresión de fructanos y levanos en plantas de S. tuberosum. Con este fin, se realizaron construcciones que contenían los genes sacB de Bacillus subtilis o ftf de Streptococcus mutans fusionados a una secuencia señal de transporte a vacuola obtenida del gen de la carboxipeptidasa Y de levadura (cpy). Las construcciones se pusieron bajo la dirección del promotor constitutivo 35S del CaMV. Estas construcciones se introdujeron en plantas de S. tuberosum.
La transparencia 19 muestra una comparación del contenido de almidón en microtubérculos de plantas controles y transformadas en relación con el contenido de fructanos de las plantas transformadas. Como se muestra en la gráfica, los microtubérculos que acumularon altos niveles de fructanos (plantas transformadas KP) mostraron severas reducciones en el contenido de almidón, con niveles que alcanzaron un tercio de los observados en las plantas controles (un promedio de 64,9 mg de almidón/g de peso fresco en microtubérculos sin transformar versus 18,9 mg/g en microtubérculos de plantas transformadas con el gen sacB). Las plantas conteniendo el gen ftf exhibieron un contenido más bajo de fructano y niveles menos reducidos de almidón. La transparencia 20 muestra resultados del mismo trabajo. Se determinó el contenido de fructano y almidón en hojas jóvenes, de mediana edad y viejas, en plantas controles y transgénicas conteniendo el gen sacB (gráfico de la derecha). En las plantas controles de mediana edad se observaron los mayores contenidos de almidón. El análisis del contenido de fructanos en las plantas transgénicas reveló que los fructanos se acumulaban durante todo el desarrollo de la hoja. Los más altos niveles de fructano se alcanzaron en las hojas más viejas, pero las hojas jóvenes y de mediana edad también presentaron incrementos significativos. La acumulación de fructanos en las hojas viejas alcanzó hasta un 30% del peso seco. La acumulación de fructanos afectó dramáticamente el total de carbohidratos no estructurales en las hojas de las plantas de Solanum (gráfico de la izquierda). Esto demuestra que el metabolismo de los carbohidratos en hojas también es afectado.
Otra especie transformada con un gen de la fructosil-transferasa fue la remolacha azucarera (Beta vulgaris). Se transformaron plantas con el gen 1-sst que codifica una 1-sacarosa:sacarosa fructosil transferasa aislada de Helianthus tuberosus (transparencias 21 y 22). En H. tuberosus, la 1-SST media los primeros pasos en la síntesis de los fructanos de bajo peso molecular (GF2, GF3 y GF4). En la raíz de las plantas de B. vulgaris transformadas, la sacarosa fue convertida en su casi totalidad en estos fructanos. En contraste, la expresión del gen 1-sst en las hojas resultó en bajos niveles de fructanos. A pesar de que la composición de los carbohidratos de almacenamiento resultó alterada, la expresión del gen 1-sst no produjo cambios visibles en el fenotipo ni afectó la tasa de crecimiento de las raíces.

Modificaciones en las rutas de síntesis de ácidos grasos
Transparencias 23-35
En forma similar a los hidratos de carbono, los ácidos grasos de distintos tipos se producen en grandes cantidades a partir de los cultivos oleaginosos como colza (canola), soja y maíz, tanto para propósitos industriales como alimentarios. La ingeniería metabólica ha comenzado a jugar un rol importante en el mejoramiento de estos cultivos, ya sea incrementando la producción de ácidos grasos existentes como en el diseño de nuevos productos. La canasta tradicional de oleaginosas está compuesta principalmente por trece cultivos: algodón, coco, colza, girasol, lino, maíz, maní, oliva, palma de aceite, palmiste (palma kernel), ricino, soja y sésamo (ajonjolí). La de grasas animales la componen la manteca de cerdo, el sebo, la manteca (mantequilla) y los aceites de pescados. En la tabla de la transparencia 24 se muestran los valores de la producción mundial de aceites y grasas desde 1990 al 2002. Puede observarse que los aceites de soja, palma, colza y girasol representan el 67% de la producción mundial de grasas y aceites en el acumulado 1998-2002. En este cuadro no se tiene en cuenta la producción de grasa de cerdo, de aves de corral, de pescado, de otras grasas animales y de sebo. En quinto lugar está ocupado por el ghee, una mantequilla líquida clarificada por evaporación. La posición número 14 incluye aceites y grasas derivadas de peces y afines, excluyendo mamíferos.
Los constituyentes primarios de los aceites y las grasas son los triacilgliceroles (TAGs), los cuales están compuestos por ácidos grasos y glicerol. Los TAGs que son líquidos a temperatura ambiente son denominados aceites, mientras que aquellos que son sólidos bajo estas condiciones son conocidos como grasas. La composición de ácidos grasos de los TAGs determina el rango de aceites y grasas para propósitos nutricionales. Ello permite discriminar entre los lípidos que son considerados colesterogénicos y aquellos que no lo son. Los ácidos grasos de propiedades especiales abren un gran campo de aplicaciones técnicas para la síntesis oleoquímica. Estas aplicaciones no nutricionales dependen de la composición de ácidos grasos de los TAGs y, en particular, de la disponibilidad de residuos grasos homogéneos. Han sido descriptos más de 210 tipos diferentes de ácidos grasos en semillas y frutas de plantas, pero sólo a unos pocos se les ha encontrado una aplicación no alimentaria. Ejemplos de ellos son el ácido láurico (C12:0), el cual es ampliamente usado para la producción de detergentes y surfactantes; los ácidos linoleico y linolénico (D9,12 C18:2, D9,12,15 C18:3) usados en pinturas, barnices y coberturas; el ácido ricinoleico (D9,12 OH-C18:1) para coberturas y lubricantes y el ácido erúcico (D13 C22:1) como lubricante, agente antideslizante y como precursor de la síntesis de Nylon entre otras cosas. Los ejemplos que se describen en la transparencia 25 muestran las principales características que se tienen en cuenta en la clasificación de los ácidos grasos: a) variación en la longitud de la cadena; b) variación en la posición números de dobles ligaduras y c) sustitución por grupos funcionales.
La transparencia 26 muestra un esquema general de los pasos implicados en las rutas biosintéticas de los ácidos grasos. Las enzimas individuales de síntesis de ácidos grasos polimerizan en forma secuencial unidades de C2 derivadas de acetil-CoA a una cadena acil en crecimiento, la cual está unida a una pequeña proteína (proteína transportadora de acilos; ACP). En una serie de 7 ciclos de condensación, se produce un acil-tioester de C16:0, palmitoil-[ACP], lo que requiere, entre otras actividades, de la acción de una enzima de condensación (b-cetoacil-[ACP] sintetasa I; KAS I). La terminación prematura de la cadena por clivaje tiolítico de los intermediarios de acil-[ACP] mediante la expresión de acil-[ACP] tioesterasas específicas puede resultar en la producción de ácidos grasos de cadenas cortas e intermedias C8:0-C14:0. El palmitoil-[ACP] es el punto de partida para la producción de ácido petroselínico en semillas de coriandro. En muchos tejidos vegetales en que se acumulan lípidos, el palmitoil-[ACP] es elongado a estearoil-[ACP] C18:0 por una KAS II específica. La desaturación de estearoil-[ACP] a oleoil-[ACP] es catalizada por una enzima soluble, la D9-estearoil-ACP desaturasa, presente en el plástido. La sobrexpresión de esta enzima resulta en la producción de aceites con alto contenido de ácidos grasos insaturados y con bajos niveles de ácido esteárico. En general, el ácido graso producido en mayor cantidad en las plantas es el ácido oleico, el que es liberado por la acción de la oleoil-[ACP] tioesterasa y activado a oleoil-CoA por una acil-CoA sintetasa en la envoltura externa del cloroplasto mientras es exportado al retículo endoplásmico. El ácido oleico es incorporado en TAGs de almacenamiento durante la maduración de la semilla. En la membrana del retículo endoplásmico, se encuentran enzimas que introducen diversas modificaciones tales como insaturaciones (desaturasas específicas), hidroxilaciones, conjugaciones, epoxidaciones, acetilaciones, elongaciones y reducciones.

La tabla de la transparencia 27 describe la composición de ácidos grasos de aceites obtenidos de algunos cultivos de interés comercial. La tabla de la transparencia 28 muestra ejemplos de ácidos grasos no comestibles simples o conjugados y de las especies vegetales que los producen. El tratamiento de ácido erúcico y de ácido petroselénico con ozono da origen a productos de interés para la industria. El ácido láurico es utilizado para la fabricación de detergentes, surfactantes y shampúes. Los ácidos dicarboxílico y brassílico pueden emplearse para la producción de Nylon.


La transparencia 29 enumera los principales objetivos perseguidos en la modificación de ácidos grasos mediante ingeniería genética. Los perfiles de ácidos grasos pueden modificarse para obtener distintas proporciones de ácidos grasos saturados, monoinsaturados, de cadena media o con distintas sustituciones. Para ello, se introducen en la planta los genes de las enzimas apropiadas o se inhibe (mediante introducción de genes antisentido o silenciamiento génico) la expresión de las enzimas endógenas responsables del paso biosintético involucrado.
Los aceites con alto contenido de ácidos grasos saturados como palmítico y esteárico tienen gran demanda industrial, ya que son utilizados para la fabricación de jabones, detergentes y cosméticos. La mayoría de las plantas producen aceites con bajo contenido de ácidos grasos saturados. En las transparencias 30 a 32, se presenta un ejemplo en el que se modificó el perfil de ácidos grasos en semillas de Brassica napus y Brassica rapa con el objeto de incrementar la producción de ácido esteárico. Con tal fin, se realizaron construcciones con genes antisentido de la estearoil-ACP desaturasa de B. rapa para reducir la síntesis de ácidos grasos insaturados. Este procedimiento permite inhibir, total o parcialmente el siguiente paso de síntesis.
estearil-ACP-desaturasa

18:0- ACP ----------------------------------------4 18:1-ACP

(estearoil-ACP) + O2 (oleoil-ACP)

+ ferredoxina


Las construcciones antisentido fueron puestas bajo la regulación de genes que se expresan durante el llenado de la semilla, es decir durante el período de máxima síntesis de ácidos grasos.
La transparencia 31 muestra los perfiles de ácidos grasos en semillas de las plantas transgénicas obtenidas con las construcciones previamente descriptas. Se observó que las semillas de la línea 3242-T-1 contenían hasta un 32% de estearato. En base a los niveles de estearato, se dividió a las semillas en dos grupos que correspondían a la segregación mendeliana del transgen: con alto estearato y con niveles normales de estearato. En las gráficas se observan los perfiles de la composición de ácidos grasos de cada grupo. Se analizaron 50 semillas maduras de la línea 3242-T-1. De ellas, 21 resultaron contener alto estearato (niveles que variaban entre 21,5% a 32%), y 29 resultaron con niveles equivalentes a las plantas control (Tobin) sin transformar (niveles entre 1,0-1,6%). El incremento de estearato fue acompañado por un descenso en los niveles de ácido oleico, el producto de reacción de la estearil-ACP desaturasa.
La transparencia 32 muestra un análisis de extractos de 10 semillas de la planta transgénica 3242-T-1 y de 10 semillas de una planta control para determinar los niveles de desaturasa y el contenido de estearato. El fenotipo de alto estearato se correlacionó con una marcada reducción de la enzima en el análisis de Western blot. Por el contrario, las semillas 3242-T-1 (segregantes no transgénicos) o las semillas control no transformadas (Tobin), exhibieron niveles no normales de estearato y de expresión de la enzima.
Los aceites compuestos con ácidos grasos saturados de cadena media también son utilizados en la industria cosmética para la fabricación de jabones, champúes, etc. Estos ácidos grasos están presentes en algunos cultivos como palma, cocotero, Cuphea, pero no en las semillas de los cultivos extensivos. La transparencia 33 muestra un ejemplo en el cual se cambió el perfil de ácidos grasos en detrimento de los de cadena larga y en favor de los de cadena media. La 12:0 acil-ACP-tioesterasa es una enzima que interrumpe el proceso de elongación de los ácidos grasos para producir ácido láurico (C12:0). En el trabajo que se presenta, se transformó Arabidopsis thaliana con el gen de la 12:0 acil-ACP-tioesterasa de Umbellinaria californica. La actividad de la tioesterasa se midió en conjuntos de 40 semillas maduras obtenidas de las plantas transgénicas. La actividad de la enzima en las plantas transgénicas varió entre 300 y 1.000 mU por semilla. En contraste, las plantas control exhibieron actividades promedio de 7 mU de por semilla. Como se muestra en la tabla, el laurato se acumuló en las semillas de plantas transformadas y permaneció ausente en plantas de Arabidposis no transformadas. En la transparencia 34 se analiza el perfil de ácidos grasos en 100 semillas maduras de cada planta por cromatografía gas-líquido. Las plantas transformadas exhibieron un alto contenido de ácido láurico y un descenso concomitante de algunos ácidos grasos de cadena larga (³ 16). La única excepción fue el linolenato, el que no fue afectado por la acción de la enzima introducida. El total de ácidos grasos por semilla permaneció sin cambios.

Debido al amplio conocimiento disponible sobre la síntesis de ácidos grasos en distintos organismos, dentro de las limitaciones que imponen los efectos fisiológicos no deseados, es posible cambiar el perfil de ácidos grasos de una especie vegetal en un rango muy amplio de composiciones. La tabla de la transparencia 35 muestra ejemplos de modificaciones introducidas en B. napus (colza), uno de los cultivos en que más trabajo se ha realizado al respecto. El aceite producido por las semillas de B. napus posee un alto contenido de ácido erúcico, lo que lo torna inadecuado para usos alimentarios. La supresión de la expresión de la oleoil-CoA-elongasa en una mutante natural seleccionada por mejoramiento clásico permitió eliminar la producción de ácido erúcico y desarrollar el cultivo comercial (canola, por canadian oil). El aceite de canola posee un alto contenido de ácido oleico (62%) y niveles elevados de aceites omega 6 y 3 (22% y 10%, respectivamente). La introducción por ingeniería genética de distintas tioesterasas, desaturasas, elongasas y secuencias antisentido (listadas en la tabla) en este cultivo ha permitido cambiar su composición de ácidos grasos en forma sustancial. Trabajos similares han sido efectuados en la soja (Glycine max). Algunas de estas variedades transgénicas han ingresado ya en la etapa comercial.



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