CÁtedra de fisiología- añO 2009



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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL

FACULTAD DE Cs. VETERINARIAS

CÁTEDRA DE FISIOLOGÍA- AÑO 2009


TRABAJO COMPLEMENTARIO N° 4


TEMA: PROTEINAS PLASMÁTICAS, HEMOSTASIA Y GRUPOS SANGUÍNEOS.
La sangre es un tipo especializado de tejido conectivo compuesto por una fase celular integrada por células (glóbulos rojos y glóbulos blancos; neutrófilos, basófilos, eosinófilos, linfocitos y monocitos) y derivados celulares ( ej. Plaquetas); y una fase liquida constituida por el plasma que forma parte del conjunto de fluidos corporales.
El plasma esta constituido por un 90% de agua y diversas sustancias como ser electrolitos, gases, hormonas, productos metabólicos, productos de desecho y proteínas plasmáticas.
Para obtener plasma completo es necesario agregar a la sangre un agente anticoagulante y centrifugar la muestra.
Si se la deja la sangre sin anticoagulante, coagula. El fibrinógeno se convierte en fibrina y ésta forma la red que aprisiona los elementos formes. Después de la retracción del coagulo, se separa un liquido, el suero sanguíneo. El suero es plasma desprovisto de fibrinógeno.


PMNG: POLIMORFONUCLEARES GRANULOCITOS, MNG: MONONUCLEARES AGRANULOCITOS, N: NEUTROFILOS, B: BASÓFILOS, E: EOSINÓFILOS, M: MONOCITOS, L: LINFOCITOS

Una de las técnicas utilizadas para determinar y cuantificar los distintos tipos de proteínas plasmáticas es la Electroforesis.

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.

La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.

La electroforesis proteica

Es la separación de proteínas mediante la aplicación de un campo eléctrico.

Existen diferentes tipos en función del tipo de separación empleado: electroforesis de zona (separación en función de la carga), isoelectroenfoque y separación por tamaño en tamiz molecular (también aplicable a ácidos nucléicos).


Técnicas


Electroforesis de zona: Las proteínas son moléculas anfóteras: su carga neta depende del pH del medio. Normalmente, la separación electroforética de proteínas se hace a pH alcalino, en el que la mayoría de las proteínas presentan una carga global negativa. También se puede trabajar a pH ácidos, pero no demasiado bajos, ya que las proteínas precipitan en medio ácido (básicamente se usa en la detección de variantes de la hemoglobina).

Como medio de soporte se puede usar (de más antiguo a más reciente): papel, acetato de celulosa, agarosa, poliacrilamida y electroforesis capilar. La muestra cuyas proteínas se quieren separar se inserta en un medio de soporte y se aplica una diferencia de potencial durante un tiempo determinado para separar las proteínas. Cada proteína migrará más o menos en función de su carga (que también determina hacia qué polo se dirigirá la proteína, ánodo (+) o cátodo (-)) y su tamaño. A mayor carga y menor tamaño, más velocidad de migración.



Isoelectroenfoque En lugar de separar las proteínas en función de su carga a un pH dado, se separan en función de su punto isoeléctrico (pI): el pI es el pH en el que la carga neta de la proteína es nula, y depende de la composición aminoacídica de la proteína. Se crea un gradiente de pH mediante anfolitos (estabilizan el pH a lo largo del gel). Cada proteína migrará hasta alcanzar su pI, punto en el cual precipitará al acumularse (de ahí el nombre, isoelectroenfoque).

También se suelen utilizar acoplados a zimogramas si deseamos determinar el pI de una enzima o en electroforesis bidimensional como primera dimension.



Separación por tamaño Permite separar proteínas y ácidos nucléicos. En el caso de las proteínas, deben ser tratadas con SDS (sodio dodecil sulfato) para que su carga sea negativa y todas migren hacia el ánodo (no es necesario hacer eso con los ácidos nucléicos, ya que tienen carga negativa); la separación se hace en medios de soporte en el que se ha creado un tamiz molecular (matriz), que hace que las proteínas más pequeñas corran más que las más grandes.

Visualización


Una vez separadas las proteínas, deben fijarse y teñirse para poder ser visualizadas. Hay diferentes protocolos en función de lo que se quiere estudiar: fijación por calor o química y tinción en caso de estudios no específicos (proteinograma y electroforesis Hb, por ejemplo) o fijación mediante anticuerpos previa a la tinción en caso de estudiar proteínas específicas (Inmunofijación).

Por lo general para la tinción de geles de poliacrilamida se utiliza tinción con plata, tinción de Coomassie o tinción fluorescente. Dependiendo del fin de nuestro análisis. La tinción con plata no es utilizada si se desean hacer análisis por espectrometría de masas (MS) pero es más sensible que la tinción con Azul de Coomassie, por otro lado, la tinción fluorescente es muy sensible y compatible con MS pero los costos de tinción son elevados.

Una tinción sensible y barata es la denominada "Blue Silver" o Coomassie G250[1] . Además, esta tinción es compatible con MS. Esta compuesta por azul de coomassie diluido en una solución coloidal y se utliza agua destilada para desteñir el gel de poliacrilamida.

Aplicaciones


Pueden analizarse las proteínas contenidas en diferentes líquidos biológicos: sangre, plasma (el líquido sanguíneo sin células), suero (plasma sin fibrinógeno), orina, LCR, líquido sinovial, saliva, lágrimas. Así como alimentos, especialmente lácteos y cereales.

Este tipo de análisis electroforético tiene aplicaciones en investigación y en clínica, tanto humana como animal. Además es una técnica muy empleada para el análisis de proteínas alimentarias y últimamente se empleando para realizar genotipado y detección de OMG(Organismos Modificados genéticamente)


Principales proteínas del plasma sanguíneo:

ALBUMINAS: es la mas abundante de las proteínas del plasma. Es una proteína globular de alrededor de 69 kDa, constituida por una sola cadena de polipeptídica formada por 610 aminoácidos. Tiene numerosos grupos reactivos en su molécula que le permiten unirse a gran variedad de sustancias (ácidos grasos, pigmentos biliares, hormonas esteroides, fármacos) actuando como un activo transportador. La albúmina es responsable de mas del 70% de la presión oncótica del plasma pese a que representa solo el 50% de las proteínas del plasma. Esto se explica porque el peso molecular es notoriamente inferior al peso promedio de las otras proteínas del plasma y, en consecuencia, en una determinada cantidad de albúmina existirá mayor número de moléculas que en igual cantidad de globulinas. Como la presión osmótica es una propiedad coligativa que depende del número de partículas en solución, la albúmina es mas efectiva como factor determinante de la presión oncótica total. Por lo tanto es la principal proteína involucrada en el mantenimiento de la volemia. Se sintetiza en el hígado y su concentración en el plasma puede estar disminuida por muchos procesos patológicos en los cuales se reduce su síntesis (desnutrición e insuficiencia hepática ) o en los que una alteración renal permite su excreción por orina (nefrosis).


GLOBULINAS: La fracción de globulinas es sumamente compleja. En general las globulinas contienen proteínas conjugadas de dos tipo principales: glicoproteínas y lipoproteínas.
Glicoproteínas: proteínas conjugadas que poseen como grupo prostético hidratos de carbonos.

Lipoproteínas: proteínas globulares en las cuales los componentes lipídicos apolares, como trigliceridos y esteres de colesterol se disponen en el interior del complejo rodeados por fosfolípidos, colesterol y proteínas que ubican las porciones hidrofóbicas de sus moléculas hacia adentro en contacto con el núcleo apolar y sus funciones polares hacia el exterior, lo cual otorga hidrofilia al conjunto y asegura su estabilidad en el medio acuoso. Se reconocen varias categorías que difieren entre si en contenido de lípidos y proteínas, en su densidad y su movilidad electroforética. El peso específico de las lipoproteínas es tanto menor cuanto mayor es su contenido o proporción de lípidos.


La fracción de globulinas α presenta dos bandas en el proteinograma α1 y α2 excepto en pequeños rumiante y en el cerdo. La mayoría son sintetizadas en el hígado y entre ellas se encuentran:

Globulinas α1: Glicoproteínas

ANTITRIPSINA: principal inhibidor de proteasas existentes en el plasma, protege a las tejidos, especialmente al pulmonar, de la acción de elastasas liberadas por granulocitos polimorfonucleares (neutrófilos, basófilos y eosinófilos)

PROTROMBINA: precursor de la trombina. Cataliza la conversión del fibrinógeno en fibrina, etapa final de la cascada de coagulación.

TRANSCORTINA: transporta cortisol



Globulinas α2: Glicoproteínas

CERULOPLASMINA: proteína que contiene 8 átomos de Cu por cada molécula. Tiene actividad enzimática como ferroxidasa.

HAPTOGLOBINA: se une a la hemoglobina eventualmente presente en el plasma y forma así un complejo macromolecular que impide que la Hb liberada por hemólisis intravascular en condiciones normales sea excretada por orina.

MACROGLOBULINA: inhibidor de proteasas.

ERITROPOYETINA: Hormona que controla la eritropoyesis normal.

Globulinas α: Lipoproteínas: HDL y VLDL
b-globulinas :dos bandas, excepto en grandes rumiantes

Entre ellas hallamos las glicoproteínas:

proteínas del complemento: forman parte del sistema de defensa inespecífico del plasma.

Ferritina: cada molécula de esta proteína fija 2 átomos de hierro y sirve para transportar este metal en el plasma.

Si se practica electroforesis en plasma en lugar del suero entre la las globulinas beta y gama se advierte la presencia de otra fracción, que corresponde al fibrinógeno, glicoproteína que participa en la fase final de la coagulación.

fibrinógeno (separable por coagulación)


GAMA O INMUNOGLOBULINAS:

Son anticuerpos formados por el organismo frente a la presencia de sustancias que son reconocidas como extrañas a él. Son los componentes de la respuesta inmune humoral y poseen la propiedad de unirse específicamente a las sustancia extraña la cual es llamada antígeno. Se reconocen varios tipos de inmunoglobulinas que se designan con las letras G, A, M, D y E

Las gammaglobulinas son sintetizadas por las células plasmáticas derivadas de linfocitos B.
La vida media de las proteínas plasmáticas es de aproximadamente 10 días. La degradación de las proteínas y su síntesis para reemplazo es un proceso continuo, activo y regulado que permite mantener constantes las concentraciones plasmáticas. La formación de proteínas plasmáticas como la de cualquier otra proteína requiere el aporte de aminoácidos a través de la dieta. Existe una relación directa entre la cantidad y calidad de las proteínas ingeridas y la formación de proteínas del plasma tanto de albúminas como globulinas, incluyendo las gamma globulinas. Esto explica por que en estados catabólico o de desnutrición disminuyen las defensas del organismo frente a infecciones.
La concentración total de proteínas plasmáticas varía entre 6 – 8 g/dl.
En clínica tiene cierto interés conocer la relación entre las concentraciones de albúminas y globulinas cuyo valor normal es, en término medio, 0,8 a 1. La disminución de este valor es un hallazgo frecuente en clínica.


A:G

0,8-1

albúmina

45-50%

a-globulinas

8%

b-globulinas

23%

g-globulinas

23%

Por densitometría, procedimiento que mide la intensidad de la coloración en los distintos sectores de la tira coloreada, se puede obtener un trazado que dibuja una serie de ondas o picos en correspondencia con cada una de las bandas. La superficie de cada pico es proporcional a la intensidad de color y tamaño de las bandas originales. Este trazado suele designarse proteinograma electroforético.





Proteinograma de referencia para las distintas especies:
El trazado del mismo varía de acuerdo a diferentes factores fisiológicos a saber: especie, sexo, edad (recién nacidos, viejos), estado fisiológico (gestación y lactancia), estado metabólico (hidratación, hormonas), aptitud productiva (puesta de huevos, lactancia...), factores ambientales (efectos nutricionales, estrés) otros (resultados artefactuales: sobre hidratación por fluidoterapia..)

La cuantificación de proteínas totales, el perfil electroforético (proteinograma) y la relación A:G se usan en el diagnóstico de las alteraciones protéicas

HEMOSTASIA


Proceso mediante el cual el organismo evita la perdida de sangre, procedente de la ruptura de los vasos sanguíneos, más frecuentemente pequeños capilares. Presenta varias etapas, tendientes cada una de ellas a favorecer el restablecimiento del flujo sanguíneo a través del vaso dañado.

ETAPAS DE LA HEMOSTASIA





  1. F
    Hemostasia Primaria
    ase vascular

  2. Fase plaquetaria

3) Fase plasmática Coagulación Hemostasia Secundaria

  1. Fibrinólisis

1) Fase vascular



      1. Vasoconstricción refleja transitoria de origen simpático

2) Fase plaquetaria



    1. Activación plaquetaria

    2. Adhesión plaquetaria

    3. Secreción de gránulos plaquetarios

    4. Agregación plaquetaria

    5. Formación del tapón plaquetario

3) Fase plasmática



  1. Activación de factores de la coagulación (vía extrínseca, vía intrínseca)

  2. Generación del activador de protrombina- Activación de la protrombina

  3. Formación de trombina

  4. Formación de fibrina


4) Fibrinólisis

a) Lisis del coágulo


lesión de la pared del vaso


adherencia plaquetaria


ADP


"liberación "

plaquetaria



TROMBINA

agregación

plaquetaria

vasoconstricción

HEMOSTASIA





La EXPLORACIÓN BIOLÓGICA DE LA HEMOSTASIA, se refiere a los exámenes de orientación que sirven para valorar esta importante función. Las pruebas comunes de primer rastreo son:



1- Tiempo de sangría

2- Recuento de plaquetas

3- Tiempo de coagulación

4- Tiempo de protrombina
MUESTRAS PARA PRUEBAS DE HEMOSTÁSIS Y COAGULACIÓN



Examen Tipo de Muestra Cantidad mínima

Recuento de Plaquetas Sangre con EDTA 1,0 ml

Tiempo de Protrombina (*) Sangre con Citrato de sodio según volumen tubo

(*) en cualquier especie. Evitar hemodilución con el anticoagulante


Exámenes de laboratorio que evalúan función plaquetaria:
1- Tiempo de sangría

Es un estimador de la funcionalidad de la vía extrínseca de la coagulación. Evalúa la integridad de las primeras etapas de la formación del tapón hemostático, es decir el espasmo vascular y la formación del tapón plaquetario (cantidad y calidad de plaquetas). Mide el tiempo necesario para que se detenga la hemorragia, en respuesta a la incisión de vasos subcutáneos pequeños. Su valor normal oscila entre 2-6 minutos.

Técnica: realizar una incisión en el pabellón auricular o encía, (previa limpieza de la zona con alcohol), secar por absorción (sin presión) con un papel de filtro cada 30 segundos. Anotar el tiempo de cese de la hemorragia.
2- Recuento de plaquetas

Diluyente: Oxalato de amonio.

Procedimiento: Medir sangre extraída con anticoagulante hasta la marca 0,5 de una pipeta para recuento de leucocitos, y diluir hasta la marca 11 con diluyente para recuento de plaquetas. Mezclar y dejar en reposo 15 minutos. Volver a mezclar el contenido de la pipeta y cargar una cámara para recuento globular. Dejar en ambiente húmedo (cápsula de Petri con algodón humedecido) durante 15 minutos más. Contar las plaquetas de 5 cuadrados, del retículo central que se emplea para recuento de glóbulos rojos. Las plaquetas aparecen refringentes. Se favorece la observación imprimiendo un ligero movimiento al botón micrométrico del microscopio.
Cálculos
Multiplicar el número de plaquetas de los cuadraditos por 1000 obteniendo de esta manera el número total plaquetas /mm3

Valores normales: 150.000 a 450.000 plaquetas por milímetro cúbico.

También se puede realizar una estimación de las plaquetas, si previamente se conoce el Nº de glóbulos blancos totales. En el frotis coloreado usado para el recuento diferencial de glóbulos blancos (FLR), se cuentan las plaquetas existentes por campo microscópico y se multiplican por l Nº de glóbulos blancos totales/mm3.
Evaluación de la vía intrínseca:
3- Tiempo de coagulación: representa una medida del funcionamiento de la vía intrínseca de la coagulación de la sangre entera. Su valor normal es de 5-15min. Es el tiempo que transcurre hasta que se forme fibrina en cantidad suficiente para que una muestra de sangre, puesta en condiciones determinadas, pase del estado fluido al estado de gel.

Método de Lee-White:

1) Introducir dos tubos de cristal en un baño a 37ºC

2) Depositamos aproximadamente 1 ml de sangre sin anticoagulante en cada tubo y ponemos en marcha el cronómetro.

3) Uno de los tubos se saca del baño cada 30 segundos y se inclina para ver si fluye la Sangre.

4) Cuando la sangre no fluya se saca el segundo tubo del baño cada 15 segundos, cuando la sangre no fluya se para el cronómetro y se anota el tiempo.
Evaluación de la vía extrínseca:
Tiempo de Protrombina ( Tiempo de Quick): Representa una medida del funcionamiento de la vía extrínseca. La adición de tromboplastina tisular y Cl2Ca al plasma citratado desencadena la activación de esta vía. El valor normal de tiempo que tarda en aparecer la red de fibrina es de 11-13 segundos.

Técnica:

1) Mezclar la muestra de sangre con citrato sódico al 3%.( 9 partes de sangre y 1 de citrato)

2) Centrifugar la sangre previamente citratada a 3000 rpm durante 10 minutos para separar el plasma.

3) Agregar 0.1 ml de plasma a un tubo que contenga 0.2 ml de tromboplastina con Cl2 Ca colocar a 370C, accionar el cronómetro y medir el tiempo que tarda en formarse la red de fibrina


Grupos sanguíneos

Prueba Sanguínea Cruzada (Crossmatch) para Caninos y Felinos
La prueba cruzada se debe hacer antes de cualquier transfusión de sangre entera. Este procedimiento se hace para evitar reacciones de transfusión en pacientes previamente sensibilizados. Sin embargo, no previene la sensibilización a antígenos del dador que el receptor no posee. Tampoco reemplaza la tipificación de la sangre.

Hay dos tipos de prueba cruzada: mayor y menor.

El crossmatch mayor permite determinar si el receptor posee anticuerpos que lisen las células rojas del dador. Un crossmatch de menor importancia se utiliza para identificar anticuerpos en el suero del dador contra las células del receptor. A todos los animales que pudieron tener una transfusión o una preñez anterior se les debe realizar la prueba. Siempre se deben realizar dos pruebas de cruzamiento, la principal o mayor y la secundaria o menor.
PRUEBA CRUZADA MAYOR - Técnica :

Tiempo de ejecución: aproximadamente 40 minutos.

1- Obtener una muestra de sangre del receptor sin anticoagulante. Dejar coagular y colocar 1 ml de suero en un tubo identificado.

2- Centrifugar una muestra de 10 ml sangre del dador con anticoagulante. Descartar el plasma y colocar 2mL del sedimento globular en un tubo identificado.

3- Lavar las células: llenar el tubo que contiene 2mL de sedimento globular con solución salina al 0,9%, suspender las células (agitar suavemente) y centrifugár a 3400 rpm. Desechar el sobrenadante. Repetir el procedimiento dos veces más.

4- Preparar una suspensión de células rojas del donante al 4%: tomar 0.2cc del sedimento globular y agregar 4.8cc de solución fisiológica 0,9% en un tubo etiquetado con la identificación del donante.

5- Identificar seis tubos según la siguiente tabla:


Donante 1 : Mayor 37

Control 37

Donante 1: Mayor 25

Control 25

Donante 1: Mayor 4

Control 4


6- Colocar dos gotas del suero receptor y una gota de las células rojas del dador al 4% en cada tubo etiquetado Donante de la prueba mayor ( Mayor 37 – 25 y 4)

7- Colocar en cada tubo control dos gotas de suero salino al 0,9% y una gota de las células rojas del dador ( C37 – 25 y 4).

8- Incubar por 15 minutos a las siguientes temperaturas:

37º- Colocando el tubo en el baño termostático

25º- A temperatura ambiente.

4º- Refrigerando la muestra.



9- Centrifugar un minuto todos los tubos después de la incubación.

10- Observar

1) hemólisis a simple vista.

2)aglutinación:

a)- a simple vista: si las células no se resuspenden al agitar suavemente el tubo

b)- al microscopio: colocando una gota del sedimento en un portaobjetos.

En perros, cuando en la prueba principal se observa aglutinación o lisis de los eritrocitos no se debe realizar nunca una transfusión de sangre completa ni de eritrocitos concentrados. Si el cruzamiento principal no produce reacción alguna pero en el secundario existe aglutinación o lisis de los hematíes, no se puede transfundir sangre completa pero sí eritrocitos lavados con solución salina, ya que se elimina el plasma del donante y los aloanticuerpos que producen la reacción inmune. Sin embargo, en gatos la existencia de reacción en cualquiera de los dos cruzamientos, indica que un individuo es A y el otro B, por lo que la transfusión es incompatible. No determina el grupo de cada animal








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