Determinación de la Capacidad de Remoción de Cadmio in vitro de la microalga



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Determinación de la Capacidad de Remoción de Cadmio in vitro de la microalga Chlamydomonas reinhardtii con potencial para la biorremediación de sitios naturales impactados

Piña-Olavide, R. Posgrado en Ciencias Químicas, UASLP

Abstract

Metal ions principally derived from anthropogenic sources represent a grave trouble for human health due contamination of water, soil and air associated to their toxicity, bioaccumulation and no biodegradability properties. Within them, cadmium divalent is one the most hazardous and one of the three metals of most preoccupation in Mexico. Bioremediation constitutes a strategy based in the improvement of the characteristics of living organisms, tissues or biomass of plants, bacteria, fungi and algae for the treatment, biotransformation, biodegradation and removal of organic and inorganic pollutants, including metal ions. In cultures of the microalga Chlamydomonas reinhardtii exposed to 5, 10 and 20 ppm of Cd, was observed that growth rate was inhibited practically in concentrations over 10 ppm of the metal, and this result was related with an important decrease in the photosynthetic activity at this concentrations of metal, demonstrating that these are phycotoxic. C. reinhardtii was capable to remove 48-69% of metal in solution, for all concentrations of metal analyzed in a wide range from 2.5 to 20 ppm of Cadmium. The maximum amount of metal removed was achieved at 6 h of exposition, keeping these values practically constant until 5 days. The mechanism for removal, either adsorption or absorption was not evaluated. Previous reports suggest that the principal mechanism for removal is adsorption in the cell wall by polymeric compounds. The results obtained in this research showed the great capacity for removal of C. reinhardtii, which could be used for implementation of bioremediation strategies of natural polluted sites, water or soil, contaminated with elevated cadmium concentrations.



Keywords (Palabras Clave)

Bioremediation, C. reinhardtii, cadmium, microalgae




Introducción
La contaminación de sitios naturales impactados por metales diversos derivados de fuentes antropógenas se ha convertido en un problema grave para la salud de la población debido a la contaminación de suelo, agua y aire, así como a la toxicidad asociada a la capacidad de bioacumulación y a la no biodegradabilidad de los iones metálicos (Dorronsoro, et al, 2002; Nedelkoska y Doran, 2000; Garbisu y Alkorta, 2001; García, et al. 2000; Olivo, 1994; Jinadasa et al, 1999). De acuerdo a un estudio de la UASLP en conjunción con el INECC, en México las principales zonas de afectación debido a la contaminación asociada a la extracción de metales son: Zacatecas, debido a la industria minera; la ciudad de San Luis Potosí y su zona metropolitana debido a la dispersión de contaminantes originada por los vientos provenientes de la zona de fundición de minerales, donde se han encontrado elevadas concentraciones de partículas como cadmio y plomo en aire; así como Coatzacoalcos-Minatitlán (Díaz-Barriga, 1999, Aragón-Piña, et al., 2002). Dentro de éstos contaminantes atmosféricos, el cadmio es uno de los tres metales de mayor preocupación en México y éste es clasificado por la EPA como un probable carcinógeno humano (INECC, 2012). Las principales fuentes de contaminación por cadmio corresponden a los residuos de la industria de procesamiento y recubrimientos metálicos, a la producción de baterías, fertilizantes, a la minería, así como a la quema de residuos domésticos y a la descarga de aguas contaminadas en los cultivos (Mulligan, et al, 2001; ATSDR, 2008; EPA, 1986). La toxicidad se produce cuando los iones Cd2+ desplazan los iones de otros elementos como Zn, en el centro catalítico de enzimas esenciales (Antón y Lizaso, 2001; Jinadasa et al., 1999; WHO, 1992). El pulmón es un órgano muy susceptible a la exposición a cadmio, la inhalación crónica subaguda, puede producir bronquitis con daño progresivo alveolar y enfisema (Gwalteney-Brant, 2002). La exposición crónica a cadmio puede afectar riñón, producir osteomalacia y cáncer de próstata (Desi et al., 1998). Uno de los mecanismos de toxicidad mas reportado por el cadmio es el incremento de lipoperoxidación (LPO) y generación de radicales libres en cerebro y otros órganos (Manca et al., 1991).
En un esfuerzo por reducir, biotransformar y remover los contaminantes de origen metálico de suelo y agua, diversas estrategias se han implementado para el tratamiento de sitios impactados. Entre los métodos convencionales para la remoción de contaminantes metálicos se pueden mencionar el lavado de suelo, los procesos electrocinéticos, procesos de oxidación y reducción química, la ozonización, ósmosis inversa, extracción química, incineración y desorción térmica, entre otros. En EU el costo anual para la remediación de sitios contaminados alcanza cerca de 8 billones de dólares, de los cuales aproximadamente el 35% es designado para la remediación de agua y suelo contaminado por metales (Glass, 1999, 2000; Prasad, 2004 , Volke-Sepulveda, et al, 2004).
La biorremediación emerge como una alternativa tecnológica que agrupa un conjunto de estrategias basadas en el aprovechamiento y mejoramiento de las características de los organismos vivos, de tejidos y biomasa de plantas, bacterias, hongos y algas para la biotransformación, biodegradación y remoción de contaminantes orgánicos e inorgánicos; éstas estrategias se han implementado cada vez más en años recientes debido a que aportan una serie de ventajas: su bajo costo de implementación en comparación con los métodos térmicos, son amigables para el ambiente además de que no se requiere un tratamiento posterior en la gran mayoría de los casos, en comparación con los métodos electroquímicos (Hornung, 1997; NABIR,2003, Volke-Sepúlveda, 2004).
Diversos estudios se han llevado a cabo desde hace algunas décadas para evaluar la remoción de metales por algas. Entre ellas, la microalga Chlorella sp. ha mostrado una capacidad de remoción de cadmio del 48.7% en un medio con 50 μM de Cd (Matsunaga et al., 1999), Cladophora glomerata, Cladophora parriaudi, Oedogonium rivulare presentaron porcentajes mayores al 80% (80- 94%) de remoción para Co, Cu y Pb (Sternberg y Dorn, 2002). Mientras que con Scenedesmus obliquus se ha logrado una eficiente remoción de sales de potasio y minerales de aguas residuales, así como acumulación de Zn y Cd con altas concentraciones de Fósforo en el medio (Shehata, et al., 1980; Hodaifa et al., 2008), con la microalga marina Tetraselmis suecica se encontraron porcentajes de hasta 60.1% de remoción en cultivos con concentraciones de hasta 45 mg/L de Cadmio. En un estudio con la microalga Demodesmus pleiomorphus se pudo observar una remoción de 61 mg de Cd/g de biomasa en un medio con una concentración inicial de 5 ppm de Cadmio, el cual fue principalmente adsorbido a la superficie (Monteiro, et al., 2011).
C. reinhardtii es una microalga eucariota verde unicelular, que posee un único cloroplasto que ocupa aproximadamente el 60 % de la superficie celular. Es un organismo ubicuo mixotrófico fotosintético de crecimiento relativamente rápido cuyo requerimiento nutricional in vitro es simple, éste incluye cationes y sales en concentraciones bajas a traza. Debido estas características esta alga ha sido ampliamente utilizada en años recientes como modelo de estudio en biología molecular, gametogénesis, fotosíntesis, fisiología celular, ciclo celular, morfología, homeostasis y tolerancia de metales. Además, en los últimos años se ha propuesto la utilización de este organismo con fines biorremediación, para la producción de biocombustibles y proteínas de interés terapéutico. Son limitados los estudios que se han llevado a cabo con el fin de evaluar la tolerancia y el crecimiento en presencia de metales en C. reinhardtii. Estos se han centrado principalmente en la captación de los iones metálicos así como en la toxicidad de los mismos, sin ahondar en los mecanismos bioquímicos y en la evaluación de las enzimas implicadas en la detoxificación ( Rivera , 2011; Vilchez , 2001 ; Ghirardi et al , 2007 ; Gillet et al , 2006 ; Rajamani et al 2007; Newman et al 1991 ; Sodeinde y Kindle 1993 ; Schnell y Lefebvre 1993; Randolph - Anderson et al, 1993 ; Silflow y Lefebvre 2001 ; Grossman , 2000 ; Fuhrmann , 2002 ; Hanikenne , 2003 ; Merchant , 1998,2007 ; Shimogawara , 1998; Awad-Tin Chun-Chu, 2005 ) .
Entre los mecanismos de tolerancia que los organismos acuáticos han podido desarrollar para enfrentar el exceso de metales pesados en sus células, se encuentran: (1) unión del metal a la pared celular, (2) reducción del transporte a través de la membrana celular; (3) incremento en la salida o eflujo de metales hacia el exterior (4) compartimentalización del metal una vez que entra en la célula; (5) formación de complejos con proteínas (de tipo metalotioneína), compuestos orgánicos (citrato, malato, aminoácidos) o inorgánicos (sulfuros), de manera de atrapar el metal disminuyendo su concentración en forma libre en la célula; (6) síntesis de proteínas o metabolitos de estrés, protectoras o reparadoras de los daños celulares producidos por el metal; y (7) formación de precipitados insolubles en forma de gránulos de Ca/ Mg o Ca/S. Al parecer el principal mecanismo de defensa en algas es la producción de péptidos de tipo fitoquelatina cuyo precursor es el antioxidante glutatión (Tomsett y Thurman, 1988; Simkiss y Taylor, 1989; Viarengo y Nott, 1993; Neumann et al., 1994). El glutatión (GSH) es sintetizado a partir de sus aminoácidos constituyentes en dos reacciones enzimáticas secuenciales y dependientes de ATP, catalizadas por la γ-ECS (γ-glutamilcisteín sintetasa) y la GS (glutatión sintetasa) respectivamente. La síntesis de esta molécula clave en la respuesta antioxidante ocurre tanto a nivel de citosol como de cloroplastos (Foyer et al., 1995; Hell y Bergmann, 1990; Ruegsegger y Brunold, 1993). La enzima PC posteriormente cataliza la elongación de los residuos (γ-Glu-Cys)n al transferir un grupo γ-Glu-Cys al glutatión (Zenk, 1996).

Materiales y Métodos
Curvas de Crecimiento en presencia de Cadmio
La cepa silvestre utilizada en la presente investigación fue la CC-125 mt+ de C. reinhardtii amablemente proporcionada por la Universidad de Illinois, a la UASLP. El preinóculo se preparó a partir de una suspensión celular obtenida mediante la centrifugación de cultivos de C. reinhardtii en medio líquido TAP en la fase exponencial de crecimiento. Se emplearon matraces Erlenmeyer de 250 mL conteniendo 50 ml de medio TAP y se tomaron muestras cada 24 horas y durante 8 días se determinó la D.O. 750 con el Lector de Elisa iMark Bio-Rad. Las curvas de crecimiento se realizaron por triplicado ajustando la D.O. 750 inicial de los cultivos a 0.15. Estos cultivos se mantuvieron a 25°C con una fuente de luz blanca (60 µmol m2 s-1) en condiciones de fotoperiodo y en agitación constante a 150 rpm.

Las soluciones a una concentración final de Cadmio de 5, 10 y 20 ppm fueron preparados a partir de una solución stock de 1000 ppm de Cd, la cual fue previamente filtrada empleando membranas de papel filtro de 0.45 mm (Mondal, et al. 2008). Adicionalmente, con el propósito de determinar el pH de los cultivos de C. reinhardtii expuestos a 5, 10 y 20 ppm de Cadmio y detectar variaciones que puedan afectar la biodisponibilidad y captación por la célula, se realizaron determinaciones las 6, 12 y 24 horas y posteriormente cada 24 horas durante 7 días en los cultivos expuestos al metal.



Determinación de clorofila de cultivos expuestos a Cadmio
Para determinar la concentración de clorofila de los cultivos de C. reinhardtii expuestos a Cadmio se tomaron muestras a las 24, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 h de cada uno de los cultivos expuestos a 5, 10 y 20 ppm del metal. Se colectaron muestras de 95 μL que correspondieron a 0.1 g de suspensión celular, de acuerdo al cálculo del valor obtenido de densidad relativa en g/cm3 mediante picnométro (Blaubrand) calibrado a 50 cm3 a 20°C. El contenido de clorofila se extrajo en 10 mL de acetona (grado reactivo, Fermont) al 80% (v/v). Las células se maceraron y los extractos obtenidos se centrifugaron a 3500 rpm por 3 min en tubos cónicos de 50 mL, se separó el sobrenadante y se obtuvieron valores de D.O.750 a 645, 652 y 663 nm
Evaluación de la capacidad de Remoción de Cadmio de cultivos de C. reinhardtii por EAA
Se prepararon por triplicado cultivos de C. reinhardtii matraces de 250 conteniendo 50 mL de medio TAP líquido, cuya D.O. 750 fue de 0.15. Los cultivos se propagaron a 25°C con una fuente de luz blanca (60 µmol m2 s-1) en condiciones de fotoperíodo y en agitación constante a 150 rpm. Se obtuvieron alícuotas de 1 mL de cada suspensión celular expuestas a 2.5, 5, 7.5, 10 y 20 ppm de Cadmio a los tiempos 0,3,6,12,24,48,72,96 y 120 h. Cada una de las muestras obtenidas se centrifugó a 8000 rpm en tubos Eppendorff de 1.5 mL y se recuperaron los sobrenadantes en recipientes HDPE adicionando HNO3 a una concentración final de 5% y se conservaron a 4°C para su posterior análisis mediante Espectrometría de Absorción Atómica (Varian EspectraAA 220 FS) mediante el método de Flama.
Resultados y Discusión
Con el propósito de determinar de qué manera afecta el Cadmio el crecimiento de C. reinhardtii cepa silvestre se expusieron cultivos en medio TAP líquido a las concentraciones 5, 10 y 20 ppm del metal. Los cultivos se incubaron a 25°C con una fuente de luz blanca con una intensidad de 60 µmol m2 s-1, fotoperíodo y en agitación constante a 150 rpm. Los resultados del comportamiento del crecimiento en presencia del metal se muestran en la figura 1.

Figura 1. Curvas de crecimiento de suspensiones celulares de C. reinhardtii CC-125 expuestas a las concentraciones de 5, 10 y 20 ppm de cadmio.

Fue posible apreciar (figura 1) que a una concentración de 5 ppm de Cadmio existió una ligera disminución en el crecimiento en relación a la cepa control que corresponde a la cepa silvestre CC-125 de C. reinhardtii desarrollada en ausencia de cadmio. Para la curva control y la curva correspondiente a la concentración de 5 ppm de Cadmio se apreció una fase de adaptación entre el tiempo inicial y el día 1, seguida de una fase exponencial que alcanza un máximo al día 2 en la curva control. La fase estacionaria inició a partir del día 4, en la cual se mantuvo la absorbancia dentro de valores similares y presentó mínimas fluctuaciones hasta el día 7 del experimento.

A una concentración de 5 ppm de Cadmio no se produjo un efecto negativo significativo en la reducción del crecimiento de C. reinhardtii posiblemente debido a que la mayor fracción del metal fue retenido a nivel de la pared celular, que constituye la principal barrera. La adsorción del metal en pared celular impide que éste afecte enzimas esenciales del metabolismo y permite que no se vea inhibido el crecimiento, al evitar su ingreso. El metal que logra atravesar pared y membranas celulares puede ser detoxificado al interior celular mediante mecanismos de conjugación con grupos -SH de péptidos, entre ellos las fitoquelatinas sintetizadas en respuesta a metales, siendo el cadmio es el más potente inductor de su biosíntesis (Zhang y Majidi 1994; Zenk, 1996; Oven et al., 2001; Rama y Rai, 2010).

A las concentraciones de 10 ppm y de 20 ppm (figura 1) se redujo prácticamente la D.O.750 a la mitad al día 3 de crecimiento, además para la concentración de 20 ppm se alcanza al día 7 un valor cercano a cero, indicativo de inhibición resultado que se complementó con la observación de células lisadas al microscopio lo que indica que esta concentración es tóxica para la célula. Es posible que el metal está inactivando proteínas esenciales al interactuar con los grupos sulfhidrilo de los residuos de cisteína o por competir directamente con los cationes divalentes en el sitio catalítico de enzimas esenciales implicadas en el crecimiento; además se ha reportado que el cadmio genera un estrés oxidativo mediante síntesis incrementada de radicales libres que genera daño celular y lipoperoxidación de membranas (Rama y Rai, 2010; Siripornadusil, 2002). Con estos resultados se puede decir que el crecimiento se inhibe a partir de concentraciones superiores de 10 ppm de Cadmio, y que concentraciones de 5 ppm e inferiores del metal no afectan significativamente el mismo.

El efecto del cadmio en la viabilidad se evidenció por una pérdida de la permeabilidad de la membrana celular, la cual fue notoria en concentraciones de 10 y 20 ppm de Cadmio observándose mayor número de células teñidas con azul de metileno (Ver figura 2).


a

b

c
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d

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Figura 2. Tinción de azul metileno a partir de las suspensiones celulares de C. reinhardtii a los 4 días de exposición: a) Células sin tinción. b) Control c) Células expuestas a 5 ppm, d) 10 ppm y e) 20 ppm.

En las curvas control y 5 ppm de Cadmio el pH mostró un incremento gradual desde el inicio del experimento desde un pH de 7 a un pH de 8.4 y 8.1 para el control y la concentración de 5 ppm respectivamente, lo que indicó un comportamiento bastante similar. Los resultados obtenidos guardaron una estrecha relación con las curvas de crecimiento obtenidas previamente (figura 1). Se observó que los valores de pH bajos se presentaron en las concentraciones mayores de Cadmio y esto se relacionó con una inhibición en el crecimiento posiblemente debido a la severidad del estrés al que fueron expuestos los cultivos. A una concentración de 10 ppm de Cadmio se produjo una disminución importante del pH alcanzando un mínimo en el día 1, presentando un valor de pH de 5.32; mientras que en la concentración de 20 ppm el pH alcanzó un valor de 4.5 a partir del día 1 que se mantuvo y que presentó una tendencia decreciente.

El incremento del pH a una concentración de 5 ppm de Cadmio similar al control, puede explicarse debido al ingreso de cationes y otros nutrientes a la célula a los que puede acompañar un ingreso de protones, con lo que se alcaliniza el medio. A pesar del incremento del pH del medio, el cadmio se encontraría en su forma iónica debido a que se ha reportado que un pH menor a 10 favorece la solubilidad del Cadmio lo que indica que éste estará aún biodisponible para ser captado. De hecho, se ha reportado que la biosorción de cadmio en células liofilizadas de Chlamydomonas se incrementa conforme se incrementa gradualmente el pH de 2 a 10 para concentraciones de 0.05 a 8.7 mM de Cd en el medio (EPA, 1983; Adhiya et al., 2002). Por lo tanto la disminución en el pH de las suspensiones celulares expuestas a concentraciones superiores a 10 ppm de Cd favorecerá la captación de Cadmio por C. reinhardtii. Se ha descrito que ciertos transportadores de metales contribuyen primero al ingreso del metal a la célula, y segundo, a que se lleve a cabo ésta disminución del pH del medio a consecuencia de un intercambio de iones favorecido por el transportador AtCAX1, el cual es un transportador dependiente de ATP de la familia de intercambiadores de cationes que libera un protón al exterior y permite el ingreso de un catión metálico a la célula. (Hirschi, et al., 2004).

En los análisis de determinación de clorofila, se apreció un incremento en la concentración de clorofilas en el control desde 0.35 μg/mL hasta alcanzar un valor máximo de 0.45 μg/mL al día dos el cual corresponde al máximo de crecimiento observado previamente (ver figura 1). Es posible observar para el control una disminución de pigmentos al día 6, indicando el fin de la fase estacionaria y el inicio de la muerte celular, resultados que guardan estrecha relación con los obtenidos para las curvas de crecimiento. Se pudo observar que la concentración de clorofila disminuyó hasta valores de 0.22 μg/mL para la concentración de 5ppm de Cadmio y que esta disminución es gradual. El contenido de clorofila para las concentraciones de 10 y 20 ppm alcanzó valores cercanos a 0.1 μg/mL al día 2 y cercanos a cero al día 5. Al igual que en las determinaciones anteriores para la concentración de 5 ppm de Cadmio se apreció una disminución de la concentración de clorofila total menos notoria en comparación al control, mientras que concentraciones de 10 y 20 ppm de Cd mostraron una disminución mayor y rápida en la concentración de clorofilas lo que es un claro indicativo de toxicidad originada por la presencia del metal en la solución, lo cual generó la reducción de la actividad fotosintética a estas concentraciones.


En los análisis de remoción del metal por EAA, los resultados obtenidos indicaron una notable eficiencia de remoción de Cadmio en la solución por C. reinhardtii en las primeras 6 h de exposición para todas las concentraciones evaluadas, encontrándose un máximo de remoción a las 3 h para las concentraciones de 2.5 y 5 ppm de Cadmio. Para la concentración de 2.5 ppm de Cd se obtuvo una remoción de 48% hasta un 63% del metal que se encontraba inicialmente en la solución. Para la concentración de 5 ppm de Cadmio C. reinhardtii fue capaz de remover un 54-64% del metal. Para la concentración de 7.5 ppm se obtuvo un porcentaje de remoción de 66.6% a un 69% del metal en la solución, mientras que para la concentración de 10 ppm de Cd, el porcentaje de remoción obtenido fue del 58 al 64% y a 20 ppm se obtuvieron porcentajes de remoción de un 61.3 a un 66%, encontrándose que el máximo tiempo de remoción se llevó a cabo a las 6 horas, que corresponde a un valor de tiempo mayor en comparación a las suspensiones celulares expuestas a concentraciones más bajas del metal.
Se ha reportado que la adsorción de cationes metálicos por microalgas es un proceso rápido que alcanza el equilibrio en las primeras horas de exposición. En un estudio con C. reinhardtii se determinó que el decremento inicial en la concentración de Cadmio en el medio puede atribuirse en gran parte a la adsorción, mientras que un 5-10% puede ser debido a internalización. Estas observaciones pueden explicar la similitud de nuestros resultados obtenidos para las diferentes concentraciones de metal evaluadas y pueden darnos una idea de que el mecanismo predominante en la remoción, podría ser atribuido en gran medida a la adsorción. Se ha reportado que en la remoción de cadmio por células inmovilizadas de C. reinhardtii se produce un equilibro a las 120 h; los resultados obtenidos en la presente investigación fueron bastante similares. Se ha reportado que la concentración de metal que puede formar complejos y ser captado varía en los diferentes sistemas de microalgas y depende de la concentración del catión, el número de células, las condiciones de incubación y las condiciones del medio de cultivo (Kola et al., 2004; Hassler et al., 2004; Bates et al., 1982; Adhiya et al. 2002; Jiang et al, 2012). Aunque en la literatura no existen reportes del uso de C. reinhardtii enfocados en biorremediación, el análisis de la capacidad de remoción de Cd en esta investigación confirma la posibilidad de plantear el uso de esta microalga para la remoción de metales en sitios contaminados.
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