Erinnyis ello (L.) (Lepidoptera: Sphingidae)



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Caracterización morfológica, biológica y genética de un aislamiento Colombiano de granulovirus de Erinnyis ello (L.) (Lepidoptera: Sphingidae)

Título en ingles: Characterization of a Colombian isolate of Erinnyis ello granulovirus (L.) (Lepidoptera: Sphingidae)

Titulo corto: Granulovirus de E. ello

Gloria Barrera*, Juliana Gómez**, Paola Cuartas**, Guillermo León***, Laura Villamizar****



*Ph.D. Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia. gbarrera@corpoica.org.co. (Autor para correspondencia).

**Microbiólogo. Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia. jagomez@corpoica.org.co. pcuartas@corpoica.org.co.

***Ph.D. (c). Corpoica. Km 17 Vía Puerto López, Meta. Colombia. gleon@corpoica.org.co

****Ph.D. Corpoica. Km 14 vía Mosquera, Colombia. lvillamizar@corpoica.org.co.

Resumen

El gusano cachón Erinnyis ello (L.) es una plaga polífaga que puede causar graves pérdidas en cultivos de caucho. El uso de granulovirus representa una alternativa interesante para el control biológico de este insecto. Tres aislamientos colombianos del granulovirus de E. ello (EeGV) recuperados en larvas de campo, fueron caracterizados morfológica y molecularmente. Los cuerpos de inclusión de los tres aislamientos presentaron forma ovoide con una única nucleocápside, con tamaño promedio de 302,9 ± 22 x 181,5 ± 16 nm. El análisis de los perfiles de restricción con diferentes endonucleasas no mostró diferencias entre los tres aislamientos, lo cual sugiere que son muestras de la misma cepa viral, denominada VG010, cuyo tamaño del genoma se estimó en 88,7 Kb. El análisis de las relaciones filogenéticas basado en las secuencias de lef-8, lef-9 y gran mostró con alta consistencia la estrecha relación entre VG010 y un aislamiento de EeGV (M34-4) previamente descrito, lo cual sugiere que son variantes genotípicas de la misma especie viral. La eficacia del aislamiento VG010 en condiciones de laboratorio sobre larvas de segundo y cuarto estadio fue de 100 % y 64 % respectivamente, mientras que la concentración letal media (CL50) fue 4,3 x 103 CI/mL. La productividad viral, osciló entre 2,1 x 109 y 3,8 x 109 CI/gramo de larva. Estos resultados representan la base para el desarrollo de un nuevo bioinsecticida para el control de la plaga en campo.



Palabras clave: Gusano cachón. Baculovirus. Control biológico. Filogenia.

Abstract

Erinnyis ello (L.) is a polyphagous lepidopteran pest that may cause serious annual losses in the rubber industry. The use of granulovirus represents an interesting alternative as a biological control agent for this insect. Three Colombian isolates of granulovirus for E. ello (EeGV) were obtained from field larvae and characterized at morphological, biological and molecular level. Occlusion bodies (OB) of the three isolates showed an oval morphology with a unique nucleocapsid, with a size of 302.9 ± 22 x 181.5 ± 16 nm. Analysis of DNA endonuclease restriction profiles did not showed differences among the three viral isolates, which means that they correspond to samples of the same viral strain, denominated VG010. The VG010 viral genome size was estimated to be approximately 88.7 kb. The analysis of the phylogenetic relationships based on selected gene sequences lef-8, lef-9 and gran showed a close relationship between VG010 and the previously described isolate EeGV (M34-4). These sequence similarities suggest that the three isolates are genotypic variants of the same viral species. The in vitro efficacy of the VG010 isolate against second and fourth instar larvae was 100 and 64%, respectively, while the mean lethal concentration (LC50) was 4,3 x 103 OB/mL. The viral productivity ranged between 2.1 x 109 and 3.8 x 109 OB/g of larvae. These results represent the basis to develop a new biopesticide control agent for the pest in the field.

Key words: Hornworm, baculovirus, biological control, biopesticide.

Recibido: enero 24 de 2014 Aprobado: octubre 26 de 2014

Introducción

Erinnys ello (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Sphingidae) es una plaga polífaga con amplia distribución en zonas tropicales y subtropicales de América desde el sureste de Brasil, Argentina y Paraguay hasta el sureste de Estados Unidos (Bellotti et al., 1999). Esta especie posee un amplio rango de hospederos con descripciones en más de 35 plantas diferentes, los cuales incluyen cultivos con importancia económica como tomate, tabaco y algodón, siendo muy frecuentes los ataques a plantaciones de yuca y caucho (Winder, 1976).

En caucho, las larvas de E. ello también conocido como gusano cachón, se alimentan inicialmente de las hojas más jóvenes de las plantas y en casos severos de infestación pasan a hojas de mayor edad, causando defoliaciones totales con reducción en la producción de látex. El impacto económico negativo que puede causar la plaga en el cultivo de caucho en Colombia es de gran relevancia, teniendo en cuenta que se encuentra dentro de la apuesta exportadora del país y que sus áreas cultivadas se han incrementado vertiginosamente durante los últimos 10 años. Aproximadamente 40 enemigos naturales de E. ello han sido identificados incluyendo parasitoides de huevos y larvas, depredadores en huevos, larvas y pupas, además de hongos, bacterias y virus. Sin embargo, debido al comportamiento migratorio de los adultos, la abundancia de enemigos naturales no previene las explosiones periódicas de la plaga (Bellotti et al., 1992).

Entre los organismos entomopatógenos que afectan este insecto, se encuentra el Granulovirus de E. ello (EeGV), el cual presenta alta especificidad y virulencia. El virus EeGV pertenece a la familia Baculoviridae, que incluye el género Betabaculovirus, (ICTV, 2012) correspondientes a granulovirus que infectan insectos del orden Lepidoptera. Su ADN es circular de doble cadena, cuyo tamaño se encuentra entre 99 y 178 Kb. Los granulovirus se caracterizan por formar cuerpos de inclusión (CI) proteicos con forma de gránulo y generalmente, un único virión ocluido, lo cual lo protege de las condiciones medioambientales, favoreciendo la transmisión horizontal del virus (Rohrmann, 2010).

La diversidad de los granulovirus ha sido ampliamente estudiada, principalmente en virus que infectan insectos plaga de cultivos agrícolas de importancia económica. Existen varios reportes acerca del análisis con endonucleasas de restricción (REN) de diversos granulovirus y en la actualidad 15 especies tienen secuenciado su genoma completo. El perfil REN es una metodología sencilla, ampliamente utilizada para diferenciar cepas o aislamientos geográficos de Baculovirus (Barrera et al., 2011; Berretta et al., 1998; Escribano et al., 1999), los cuales a pesar de ser de la misma especie pueden variar su perfil REN por mutaciones puntuales o pequeñas inserciones o deleciones (Erlandson, 2009). Estas diferencias a nivel genómico frecuentemente influyen en la patogenicidad y la virulencia de los diferentes aislamientos (Cory and Myers, 2003; Erlandson et al., 2007).

Varios aislamientos de EeGV provenientes de cultivos de yuca se han utilizado para el control de E. ello en Brasil, Colombia y Venezuela, con eficacias superiores al 90% (Schmitt, 1988). El análisis molecular de un aislamiento colombiano de EeGV demostró diferencias con respecto a otros granulovirus aislados de diferentes especies de insectos (Finnerty et al., 2000) y el análisis REN de diferentes aislamientos de EeGV en una región geográfica de Brasil demostró la presencia de genotipos distintos en diferentes períodos de tiempo (Costa et al., 2005). El objetivo del presente estudio fue caracterizar tres aislamientos colombianos de EeGV, como base para el posible desarrollo de un bioinsecticida para el control del gusano cachón en Colombia.

Materiales y métodos

Cría de insectos de E. ello

La cría de larvas de E. ello se estableció en condiciones controladas en el Centro de Investigación La Libertad, de Corpoica (Villavicencio, Colombia), utilizando follaje de yuca como fuente de alimentación. En el interior de una casa de malla, se establecieron tres módulos de anjeo de 2m x 3m x 2m, dentro de los cuales se sembraron plantas de yuca en diferentes épocas del año. Se colectaron huevos de E. ello en campo y se mantuvieron en cajas plásticas hasta su eclosión. Las larvas neonatas se ubicaron en recipientes plásticos dotados de la fuente alimenticia y se mantuvieron hasta que alcanzaron el segundo estadio bajo condiciones de laboratorio (28 °C y Humedad relativa 75 %). Para completar las fases siguientes de desarrollo del insecto, las larvas se ubicaron sobre las plantas de yuca mantenidas en casa de malla. Las pupas formadas se colectaron en cajas plásticas con aserrín, hasta la emergencia de los adultos, los cuales se confinaron en los módulos de anjeo con plantas de yuca para cumplir en ellas sus etapas de cópula y oviposición.



Propagación y purificación viral

Tres aislamientos virales se multiplicaron en larvas de tercer estadio (L3) de E. ello. Para tal fin, se inocularon 10 hojas de yuca mediante la aspersión de 10 mL de una suspensión viral ajustada a 1 x 107 CI/mL. Cada hoja se introdujo en un frasco de vidrio y se infestó con 10 larvas sanas de E. ello provenientes de la colonia en laboratorio, los cuales se incubaron a 28 °C y Humedad relativa 75 %. Diariamente se recolectaron las larvas muertas en cada tratamiento, se codificaron y se procedió a la extracción de los CIs. Para la purificación de los CIs, las larvas muertas por granulovirus se homogenizaron con agua destilada en proporción 1:1 (1 mL de agua por cada gramo de larva) y la mezcla obtenida se filtró a través de una muselina para retirar restos de tejido del insecto. Los CIs se purificaron siguiendo la metodología descrita por Caballero et al. (1992) y se resuspendieron en agua ultrapura, para su posterior cuantificación por espectrofotometría con extrapolación del resultado en una curva de calibración previamente estandarizada.



Caracterización morfológica

Para la caracterización morfológica, los tres aislamientos de EeGV fueron procesados para su observación bajo el microscopio electrónico de transmisión. Se fijaron 100 µL de suspensión viral con igual volumen de fijador (formaldehido 4 %, glutaraldehído 1 % en tampón fosfato pH 7,4). Las muestras se colocaron en rejillas de cobre recubiertas con resina Fomvar y se realizó una tinción negativa con ácido fosfotúngstico al 2 % para su observación en un microscopio electrónico Philips CM10. El tamaño de los cuerpos de inclusión se determinó mediante el programa NIS-elements (Nikon).



Caracterización molecular

Para la extracción de ADN viral se tomó una suspensión purificada de CIs (1 x 108 CIs/mL) a la cual se añadió 2,5 vol. de agua, 1 vol. de Na2CO3 (0,5 M, pH 7,2) y 0,5 vol. de SDS (10 %) y se incubó durante 10 min. a 60ºC. La muestra se centrifugó a 2500 g durante 5 min. y se recogió el sobrenadante que contenía los viriones. Se añadieron 50 µL de proteinasa K (10 mg/mL) y se incubó durante 30 min. a 50ºC. La extracción del ADN se realizó mediante dos pases con fenol-cloroformo y la posterior precipitación con etanol. El ADN precipitado se resuspendió en 200 µL de tampón TE 0,1x (Tris-EDTA) y el ADN se cuantificó mediante espectrofotometría.

Para realizar los perfiles de restricción, se utilizaron 2 µg de ADN viral para la digestión con las enzimas PstI, BamHI, HindIII, EcoRI, BglII y KpnI (Takara, Shiga, Japan) durante 4–12 horas a 37 ºC. Las reacciones se mezclaron con tampón de carga (azul de bromofenol 0,25% p/v, sacarosa 40% p/v) y se cargaron en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE (Tris–acetato 0,04 M y EDTA 0,001 M). La electroforesis se realizó a 20 Voltios durante 12 horas. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron en luz UV (Chemi-Doc, BioRad, California, USA). Para el análisis de los tamaños de los fragmentos generados se utilizó el programa QuantityOne versión 4.2.1 de Biorad.

Amplificación y secuenciación genes gran, lef-8 y lef-9

Se amplificaron fragmentos parciales de los genes gran, lef-8 y lef-9 utilizando parejas de cebadores degenerados. Para el gen gran se utilizaron los cebadores directo Gran-F (5´-ATGGGATAYAAYAAAWCDYT-3´) y reverso Gran-R (5´-TYARTANGCBGGDCCVGTRAA-3´) (Barrera et al., 2009). Para lef-8 se utilizaron los cebadores prL8-1 (5´- CAGGAAACAGCTATGACCCAYGGHGARATGAC -3´) y prL8-2 (5´-CAGGAAACAGCTATGACCAYRTASGGRTCYTCSGC-3´), para lef-9 se utilizaron los cebadores prL9-1 (5´- CAGGAAACAGCTATGACCAARAAYGGITAYGCBG-3') y prL9-2 (5´-TGTAAAACGACGGCCAGTTTGTCDCCRTCRCARTC-3) (Jehle et al., 2006). El programa de amplificación por PCR consistió de un ciclo inicial de denaturación a 95°C por 4 min y 35 ciclos así: 95 ºC por 30 seg, anillamiento a 52 °C por 1 min, extensión a 72 ºC por 90 seg. Se realizó un paso final de extensión a 72 ºC por 10 min. Cada 25 µl de reacción de PCR contenían 50-100 ng de ADN genómico, dNTPs 200 μM, 0,5 μM de cada cebador, MgCl2 2,0 mM y tampón 10X (50 mMKCl, 10 mM Tris HCl, pH 9.0, 0.1% Nonidet). La reacción se llevó a cabo con 2U de Taq polimerasa (Promega M1665). Se verificó cada producto de amplificación mediante gel de agarosa al 1% teñido con SYBR-safe (Invitrogen). Los productos de PCR fueron purificados y secuenciados directamente para las dos hebras.



Análisis filogenético

Las secuencias parciales de nucleótidos de los tres genes secuenciados (gran, lef-8 y lef-9) se alinearon independientemente con secuencias homólogas de 26 granulovirus depositadas en el Genbank, mediante el programa CLUSTAL W (Larkin et al., 2007). Los alineamientos de las secuencias se concatenaron y analizaron mediante el programa MEGA versión 4 (Tamura et al., 2011). Para el cálculo de la distancia genética se utilizó el modelo de substitución nucleotídica Kimura-2 parámetros(Tamura et al., 2011). Se construyó un fenograma de relaciones filogenéticas basado en las secuencias peptídicas concatenadas de los tres genes secuenciados.



Perfil de proteínas SDS-PAGE.

Se tomaron 7 µL de viriones de una suspensión de 109 CIs/mL y se mezclaron con 5 µL de tampón de carga (Tris-HCl 125 mM; SDS 2 %; pH 6,2; glicerol 10 %; azul de bromofenol 0,004 % y 2-mercaptoetanol 5 %). La mezcla se calentó hasta ebullición durante tres minutos. Posteriormente, las muestras se separaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (gradiente 10-12 %), corrido a 80 v durante 4 h. La tinción de las bandas de proteínas se realizó con azul brillante de Commassie 0,1 % (Laemmli, 1970).



Caracterización biológica

Se determinó la patogenicidad en términos de concentración letal media del aislamiento VG010 mediante un bioensayo en laboratorio. A partir de virus purificado se prepararon suspensiones ajustadas a cinco concentraciones desde 2 x 104 hasta 2 x 108 CI/mL, empleando una curva de calibración estandarizada previamente (Datos no mostrados). Se tomaron 200 µL de cada suspensión y se mezclaron con 200 µL de una solución de sacarosa al 4% con un colorante azul de alimentos Tuska ® (Azul No. 1 y Azul No. 2) al 1%. Con cada concentración se inocularon 24 larvas neonatas de E. ello colocadas previamente en una copa plástica de 2 onzas siguiendo el método de la gota descrito previamente por Hughes y Wood (1981). Para la inoculación de los insectos, se dispensaron gotas de 2 µL dentro de cada copa y se esperó hasta que la larva bebió la suspensión de virus, lo que se evidenció por la coloración azul en el cuerpo de la larva como consecuencia de la ingestión del tratamiento (virus + solución colorante). Una vez se observó la coloración azul en el cuerpo de las larvas, se alimentaron con un fragmento de hoja de yuca previamente desinfectada (NaClO al 0,5%). Se contó con un testigo absoluto correspondiente a larvas neonatas alimentadas con dieta natural sin aplicar ningún tratamiento. Las larvas se mantuvieron bajo condiciones controladas de laboratorio (28 °C y 75 % HR). La mortalidad de las larvas se registró a los siete días después del montaje del bioensayo. Las larvas muertas se recolectaron y almacenaron a -20 °C. El diseño experimental fue completamente al azar y con cuatro repeticiones por tratamiento, cada una compuesta por 6 larvas. Los resultados de mortalidad fueron sometidos a un análisis Probit (Finney, 1952) mediante el programa BioStat (2007) para la determinación de la concentración letal media (CL50) y noventa (CL90).

Se determinó la productividad del aislamiento VG010, como el promedio de CIs producidos por gramo de peso larval. Para tal fin, se tomaron hojas de yuca y se asperjaron con una suspensión viral ajustada a 7,2 x 107 CIs/mL, utilizando un volumen de 1 mL por hoja. Las hojas inoculadas fueron dispuestas en recipientes plásticos de 4 L y se infestaron con 30 larvas de E. ello de tercer estadio provenientes de la cría. Los recipientes se incubaron bajo condiciones controladas de humedad (75 %) y temperatura (28 ºC). Cada larva muerta por infección viral fue pesada individualmente, macerada y diluida en un volumen de agua estéril conocido. Las suspensiones virales se pasaron por una capa de muselina para retirar los restos de tejido larval. A partir del filtrado obtenido se realizaron diluciones para su cuantificación a 280 nm, con un espectrofotómetro Nanodrop®. La concentración viral se estimó por extrapolación de las mediciones en una curva de calibración previamente estandarizada.

Se determinó la eficacia de VG010 bajo condiciones de laboratorio, en larvas de segundo (L2) y cuarto estadio (L4). Cinco hojas de yuca, previamente asperjadas con una suspensión de VG010 (7.2 x 107 CIs/mL) se colocaron en un recipiente de vidrio y se infestaron con 10 larvas, lo cual se tomó como unidad experimental. Se realizaron tres repeticiones por tratamiento. Se contó con un tratamiento control consistente en larvas alimentadas con hojas sin inocular. La evaluación de mortalidad se realizó 3 y 5 días después de la inoculación. La mortalidad en los tratamientos fue corregida con respecto al testigo mediante el cálculo del porcentaje de eficacia utilizando la fórmula de Schneider-Orelli (Schneider-Orelli, 1947).

Eficacia= ((A-B)/(100-B)) x 100

donde, A es la mortalidad larval obtenida en el tratamiento y B es la mortalidad obtenida en el control negativo.



La eficacia en campo se determinó en una plantación comercial de caucho (MAVALLE S.A), en un área de 16,4 ha y con presencia de larvas de E. ello entre primer y tercer estadío. Se asperjaron 2.9 x1 07 CIs/ha del aislamiento viral VG010, suspendidos en 250 L de agua, mediante una pulverizadora Jacto AJ-401LH. El diseño fue completamente al azar y cada unidad experimental consistió en 4 surcos, cada uno con 50 árboles, de los cuales se escogieron 20 árboles al azar con presencia de larvas para hacer los muestreos. De los 20 árboles por repetición, 18 se evaluaron en el tercio medio del árbol y 2 en el tercio superior, contabilizando la población natural de larvas vivas antes de la aplicación. Posteriormente se contabilizó el número de larvas vivas y el número de larvas muertas con sintomatología viral, 1, 3 y 5 días después de la aplicación. El tratamiento control se realizó sobre un área de 2 ha, en la cual no se aplicó virus. Los resultados fueron transformados mediante la fórmula Henderson y Tilton (1955) para el cálculo de la eficacia.
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