Escuela superior politecnica del litoral



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ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DEL LITORAL




Facultad de Ingeniería en Mecánica y Ciencias de la Producción

“Manejo del virus de la hoja amarilla (Sugarcane Yellow Leaf Virus, SCYLV) de la caña de azúcar (Saccharum officinarum) mediante cultivo de tejidos y el uso de agentes inductores de Resistencia Sistémica Adquirida, SAR”




TESIS DE GRADO

Previo a la Obtención del Título de:



MAGÍSTER EN BIOTECNOLOGÍA AGRÍCOLA CON MENCIÓN EN AGRICULTURA ORGÁNICA

Presentada por:



Ing. Roberto Carlos Burbano Villavicencio


GUAYAQUIL - ECUADOR

Año: 2009

AGRADECIMIENTO

Quiero dejar constancia de mi eterno agradecimiento al Centro de Investigaciones de la Caña de Azúcar del Ecuador (CINCAE), por todo el aporte científico y logístico para la culminación exitosa de esta investigación. Particularmente al Ing. Freddy Garcés, Dr. Raúl Castillo, Ing. Jorge Mendoza e Ing. Edison Silva.
Al Ing. Alberto Ortega, por su soporte constante a lo largo de toda mi colegiatura y durante el desarrollo de esta investigación.
Finalmente, al Programa Alimentario PL-480 por el apoyo y soporte complementario del PMBA–ESPOL.

DEDICATORIA


A Dios, ser supremo que rige nuestros pensamientos, pues sin su acción sería vano nuestro esfuerzo por encontrar respuestas a los interrogantes que nos plantea la naturaleza.
A mis padres Roberto y Cecilia, quienes siempre estuvieron a mi lado, constituyendo un estímulo para alcanzar mis metas trazadas.

TRIBUNAL DE GRADUACIÓN


Ing. Jorge Abad M. Dr. Raúl Castillo O.

SUBDECANO DE LA FIMCP DIRECTOR DE TESIS

PRESIDENTE



Dr. Efrén Santos O. Ing. Alberto Ortega U.

VOCAL VOCAL

DECLARACIÓN EXPRESA

La responsabilidad del contenido de esta Tesis de Grado, me corresponden exclusivamente; y el patrimonio intelectual de la misma a la ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL”.



Roberto Carlos Burbano Villavicencio

RESUMEN



El presente trabajo busca alternativas para el manejo del virus de la hoja amarilla de la caña de azúcar (SCYLV), combinando la obtención de semilla sana libre del virus y su posterior manejo para reducir las reinfecciones en campo debidas a la presencia del áfido blanco (Melanaphis sacchari Zehnt), vector del virus. Para el efecto se planteó la aplicación de herramientas de cultivo de tejidos; como son: la extracción de meristemos, inducción de callos embriogénicos y la utilización del viricida Ribavirín (Virazole); así como, el uso del ácido salicílico (AS), que actúa como elicitor en las respuestas de Resistencia Sistémica Adquirida (SAR). Adicionalmente a los tratamientos In Vitro, se utilizaron los controles de termoterapia y agua caliente. La menor incidencia del virus fue observada en las plantas tratadas con el inductor AS y en los explantes sometidos a la inducción de callos embriogénicos, seguidas de la extracción de meristemos y la aplicación de Ribavirín, que presentaron el mismo nivel de significancia estadística; mientras que, los tratamientos sometidos a termoterapia y agua caliente mostraron los niveles más altos de incidencia. El ensayo de campo para observar la reinfección de plantas meristemáticas con el SCYLV, consistió en analizar el efecto de la aplicación preventiva del insecticida sistémico imidacloprid (Confidor), alternado con acefato (Orthene), combinando con los inductores de SAR: el AS y un Kit comercial (Releaf-Stoler Co.). Tanto los insecticidas como los inductores se aplicaron hasta los ocho meses de edad a intervalos mensuales. La protección de las plantas meristemáticas, con la combinación de insecticidas e inductores de SAR, fue significativa, comparadas con el testigo sin tratamiento, a los 2, 4 y 8 meses después del transplante. En ambos ensayos, los diagnósticos virales fueron efectuados utilizando la técnica inmunoenzimática Tissue blot Immunoassay (TBIA).

ÍNDICE GENERAL


1

ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DEL LITORAL 10

Ing. Roberto Carlos Burbano Villavicencio 11

TRIBUNAL DE GRADUACIÓN 14

14

Ing. Jorge Abad M. Dr. Raúl Castillo O. 14



SUBDECANO DE LA FIMCP DIRECTOR DE TESIS 14

PRESIDENTE 14

Dr. Efrén Santos O. Ing. Alberto Ortega U. 14

VOCAL VOCAL 14

DECLARACIÓN EXPRESA 15

“La responsabilidad del contenido de esta Tesis de Grado, me corresponden exclusivamente; y el patrimonio intelectual de la misma a la ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL”. 15

Roberto Carlos Burbano Villavicencio 15

RESUMEN 16

El presente trabajo busca alternativas para el manejo del virus de la hoja amarilla de la caña de azúcar (SCYLV), combinando la obtención de semilla sana libre del virus y su posterior manejo para reducir las reinfecciones en campo debidas a la presencia del áfido blanco (Melanaphis sacchari Zehnt), vector del virus. Para el efecto se planteó la aplicación de herramientas de cultivo de tejidos; como son: la extracción de meristemos, inducción de callos embriogénicos y la utilización del viricida Ribavirín (Virazole); así como, el uso del ácido salicílico (AS), que actúa como elicitor en las respuestas de Resistencia Sistémica Adquirida (SAR). Adicionalmente a los tratamientos In Vitro, se utilizaron los controles de termoterapia y agua caliente. La menor incidencia del virus fue observada en las plantas tratadas con el inductor AS y en los explantes sometidos a la inducción de callos embriogénicos, seguidas de la extracción de meristemos y la aplicación de Ribavirín, que presentaron el mismo nivel de significancia estadística; mientras que, los tratamientos sometidos a termoterapia y agua caliente mostraron los niveles más altos de incidencia. El ensayo de campo para observar la reinfección de plantas meristemáticas con el SCYLV, consistió en analizar el efecto de la aplicación preventiva del insecticida sistémico imidacloprid (Confidor), alternado con acefato (Orthene), combinando con los inductores de SAR: el AS y un Kit comercial (Releaf-Stoler Co.). Tanto los insecticidas como los inductores se aplicaron hasta los ocho meses de edad a intervalos mensuales. La protección de las plantas meristemáticas, con la combinación de insecticidas e inductores de SAR, fue significativa, comparadas con el testigo sin tratamiento, a los 2, 4 y 8 meses después del transplante. En ambos ensayos, los diagnósticos virales fueron efectuados utilizando la técnica inmunoenzimática Tissue blot Immunoassay (TBIA). 17

ÍNDICE GENERAL 19

ÍNDICE DE TABLAS 22

ÍNDICE DE FIGURAS 23

INTRODUCCIÓN 24

CAPÍTULO 1 25

1. GENERALIDADES 25

1.1. Antecedentes 25

1.2. Categorización de semilleros de caña de azúcar. 27

1.3. Características del virus SCYLV 28

1.4. Insectos vectores y diseminación del virus 29

1.5. Alternativas para la eliminación de virus en caña de azúcar 30

1.5.1. Cultivo de meristemos 30

1.5.2. Inducción de callos embriogénicos 31

1.5.3. Tratamiento térmico y termoterapia 33

1.5.4.Tratamiento químico (agentes antivirales) 35

1.5.5. Inducción de Resistencia Sistémica Adquirida (SAR) 36

1.6. Técnicas utilizadas para el diagnóstico viral 39

1.7. Objetivos 41

1.7.1. Objetivo general 41

1.7.2. Objetivos específicos 41

CAPÍTULO 2 43

2. MATERIALES Y MÉTODOS 43

2.1. Localización geográfica 43

2.2. Empleo de técnicas de cultivo de tejidos para la limpieza de SCYLV en la variedad CR74-250 44

2.2.1. Recolección de material enfermo 44

2.2.2. Obtención de semilla enferma, aplicación de tratamiento con agua caliente y siembra en bandejas. 44

2.2.3. Aplicación de la termoterapia 45

2.2.4. Establecimiento en medio MS I y MS II 46

2.2.5. Enraizamiento de plántulas en medio MS III 47

2.2.6. Inducción de callos embriogénicos 48

50


2.2.7. Organogénesis indirecta a partir de callos embriogénicos 50

2.2.8. Aplicación de viricida y acido salicílico 52

2.2.9. Factores y tratamientos en estudio de ensayo In vitro 53

2.2.10. Diseño experimental 54

2.2.10.1. Unidad experimental 55

2.2.10.2. Número de repeticiones y observaciones 55

2.2.10.3. Análisis de datos 55

2.2.11. Variables en estudio de ensayo de campo 56

57

2.3. Evaluación de inductores de resistencia sistémica adquirida (SAR) e insecticida para evitar la incidencia del virus de la hoja amarilla (SCYLV) en la variedad B7678, bajo condiciones de campo. 58



2.3.1. Siembra del material vegetal en condiciones de campo 58

2.3.2. Factores y tratamientos en estudio de ensayo de campo 59

60

Tabla 2. Descripción de los factores y tratamientos en estudio en ensayo de campo. 61



2.3.3. Diseño experimental 62

2.3.3.1. Unidad experimental y número de repeticiones 62

2.3.3.2. Análisis de datos 62

2.3.4. Variables en estudio de ensayo de campo 63

2.3.4.4. Evaluación de la dinámica poblacional de Melanaphis sacchari Zehnt. 64

64


CAPÍTULO 3 66

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 66

3.1. Empleo de técnicas de cultivo de tejidos para la limpieza de SCYLV en la variedad CR74-250 66

3.1.1. Aplicación de tratamiento con agua caliente 66

3.1.2. Aplicación de termoterapia 66

3.1.3. Establecimiento en medio MS I y MS II 67

3.1.4. Acción del viricida Ribavirín 68

3.1.5. Grado de fenolización 68

3.1.6. Número de brotes por explante 69

3.1.7. Incidencia del virus SCYLV. 70

72

3.2. Evaluación de inductores de resistencia sistémica adquirida (SAR) e insecticidas para evitar la incidencia del virus de la hoja amarilla (SCYLV) en la variedad B76-78, bajo condiciones de campo. 73



3.2.1. Incidencia del virus SCYLV en plantas colonizadas por M. sacchari 73

3.2.2. Efecto simple de los inductores sobre la incidencia de SCYLV 75

3.2.3. Efecto simple de los insecticidas sobre la incidencia de SCYLV 80

3.2.4. Efecto en el tonelaje de caña cosechada 81

3.2.5. Efecto en el rendimiento azucarero (KATC) 82

3.2.6. Dinámica poblacional del áfido blanco Melanaphis sacchari Zehnt. 84

Se observó un aumento de la población de M. sacchari en la época seca, especialmente en noviembre, y luego decreció al iniciar la estación lluviosa. La distribución del áfido en el campo en las primeras evaluaciones fue aislada. Posteriormente la población de áfidos se incrementó mostrando hábito gregario, alcanzando en la semana ocho un promedio de 5.68 áfidos por planta. Estos resultados establecen claramente que la dinámica poblacional de M. sacchari está estrechamente relacionada con la presencia o ausencia de lluvias (Gráfico 3.12). 84

CAPÍTULO 4 87

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 87

RECOMENDACIONES: 89

APÉNDICE A 92

Dosis/Litro de medio de cultivo 92

Otros componentes 92

APÉNDICE B 94

APÉNDICE C 95

APÉNDICE D 95

APÉNDICE E 96

APÉNDICE F 96

APÉNDICE G 97

APÉNDICE H 97

APÉNDICE I 98

BIBLIOGRAFÍA 100





GLOSARIO
Anticuerpo. Sustancia existente en el organismo animal, o producida en él como respuesta a la introducción de un antígeno, que se opone a la acción de otros elementos, como bacterias, toxinas, etc.
Antígeno. Toda molécula de origen bacterial, viral o fúngica que a penetrar en un organismo animal, reacciona con los productos resultantes de la inmunidad celular o humoral (anticuerpos) y desencadena una reacción inmunitaria.
Apoptosis. Ver PCD (muerte celular programada).
Elicitor. Cualquier molécula capaz de activar los mecanismos de defensa en las plantas. Con frecuencia puede ser una proteína producida por algún patógeno.
Patógeno. Se dice del elemento de origen biótico, incluyendo a los virus; que origina y desarrolla una enfermedad.
PCD. Acrónimo de muerte celular programada (Programed Cellular Death, por sus siglas en inglés), también llamada apoptosis la cual es el resultado de una reacción de hipersensibilidad y en la que el tejido celular vegetal muere a causa de un evento celular natural el cual también puede ser inducido por condiciones patológicas.
PCR. Acrónimo de Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction por sus siglas en inglés) y hace referencia a una técnica de biología molecular descrita en 1986 por Kary Mullis[], cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo. En teoría basta partir de una única copia de ese fragmento.
Receptor. Cualquier molécula, por lo general de naturaleza proteica, que se encuentra en las membranas celulares y se encarga de recibir la información transmitida por un elicitor u otra molécula transductora de señales en las células.
SAR. Siglas de Resistencia Sistémica Adquirida (Systemic Adquired Resistance); y se refiere a los mecanismos de defensa activados por un elicitor o en respuesta al ataque de patógenos. En este proceso se activan numerosos genes cuyos productos degradan la pared celular de bacterias u hongos, destruyen células infectadas, entre otros eventos.
Variación Somaclonal. Cambios en la constitución genética de un tejido vegetal al ser sometido a condiciones de stress como radiación y/o altas concentraciones de reguladores de crecimiento.
Vector. Cualquier organismo, por lo general de la clase insecta o protozoa; que se encarga de la transmisión de enfermedades desde un individuo enfermo hasta uno sano, mediante la succión de los líquidos celulares.



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