Establecimiento in vitro del Piñón Azul Pinus maximartinezii



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Establecimiento in vitro del Piñón Azul Pinus maximartinezii (Rzedowski).
Ojeda-Zacarías Ma. del Carmena, Hugo A. Luna-Olverab, Lilia H. Morales-Ramosb, María J. Verde-Starb, Teresa E. Torres-Cepedab, Benito Pereyra-Alférezb,

Elizabeth Cárdenas-Cerdac, Emilio Olivares-Sáenzc y Raúl Salazar-Sáenzc


a Instituto Tecnológico de Nuevo León, Eloy Cavazos No 2001, Guadalupe, Nuevo León. CP. 67170, e-mail ojedacz@yahoo.com.mx

b Instituto de Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, Apdo. Postal 38F, Pedro de Alba, s/n, Cd. Universitaria San Nicolás de los Garza, N.L. México, CP. 66450.

c Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Facultad de Agronomía, Carretera Zuazua -Marín Km 17.5, Marín, N.L., CP. 66700.

RESUMEN

México cuenta con una gran cantidad de especies endémicas, entre las cuales se encuentra Pinus maximartinezii (Rzedowski) ya que está catalogada como una especie en peligro de extinción, confinada a una población de aproximadamente 2000 a 2500 árboles maduros en una superficie de 400 ha. En estos casos, es necesario establecer técnicas de propagación que permitan incrementar la disponibilidad del material vegetativo. Por lo que, el objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo para el establecimiento in vitro de Pinus maximartinezii por medio de organogénesis. Embriones cigóticos y cotiledones obtenidos de semillas maduras fueron colocados en los medios de cultivo DCR y GD adicionados con 0.3 mgl-1 y 0.5mgl-1 de BAP; 0.01 mgl-1 de NAA, permaneciendo por 6 semanas en condiciones de 26°C  2°C y un fotoperiodo de 16 h. luz y 8 h. oscuridad. Posteriormente los explantes fueron transferidos a los medios de cultivo (DCR y GD) sin reguladores de crecimiento a intervalos de 15 días, durante 6 semanas, la variable evaluada fue número de explantes con yemas. Por último los explantes fueron transferidos a los mismos medios de cultivo sin reguladores de crecimiento, adicionados con 0.1% de carbón activado, permaneciendo por 8 semanas; evaluándose el número de brotes por embrión. Los análisis de varianza mostraron diferencia significativa en medios de cultivo y concentración de reguladores de crecimiento.


1. INTRODUCCIÓN

La importancia económica de los bosques de coníferas en México es muy grande; el género Pinus constituye la mayor parte de la riqueza forestal por su amplio rango de distribución (5). El piñón azul o maxi piñón (Pinus maximartinezii (Rzedowski), ha sobrevivido a una restricción genética extrema ya que está confinado a una sola población de aproximadamente 2000 a 2500 árboles maduros en el sur del estado de Zacatecas, México y se encuentra en la lista de las especies en peligro de extinción (4 y 9).

En estos casos la propagación in vitro ha demostrado ser un método exitoso para la conservación y mantenimiento de especies en peligro de extinción (7). Sin embargo, se han observado diferentes respuestas con la utilización de medios de cultivo y reguladores de crecimiento Ojeda (10). Por lo que, es necesario ajustar el protocolo de regeneración para cada una de las especies (1 y 12). Diversos investigadores, utilizando cotiledones de embriones maduros encontraron que concentraciones distintas de benciladenina favorecen el desarrollo de brotes in vitro. (1,11). Así mismo, Niella y Rocha (8) utilizando cotiledones provistos de hipó cotilos obtuvieron una mayor respuesta con la utilización de BA. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo para el establecimiento in vitro de Pinus maximartinezii, estudiando la variable número de brotes por explante.


2. MATERIALES Y MÉTODOS

Desinfección de la semilla.- Se obtuvieron semillas intactas de conos maduros de Pinus maximartinezii. Para su desinfección se colocaron en una solución de hipoclorito de sodio comercial (6% ingrediente activo) y detergente durante 5 in.; estas fueron cepilladas y lavadas con agua. Se seleccionaron semillas de aprox. 2.5 cm. y se eliminaron las cubiertas. Posteriormente las semillas seleccionadas se llevaron a una campana de flujo laminar colocándose en una solución de H2O2 de 12.5 vol. durante 45 min.; se enjuagaron con agua bidestilada esterilizada y se transfirieron a etanol 70% por un minuto; a continuación se colocaron en una solución de hipoclorito de sodio comercial (6% ing. activo) adicionado de 0.5cc de Tween-20 (poliexietileno sorbitan monovalente) durante 5 min. Finalmente se enjuagaron por 5 min. con agua bidestilada esterilizada.

Se utilizaron los medios de cultivo DCR y GD (2,3). Adicionados con 0.3mgl-1 y 0.5mgl-1de BAP; 0.01mgl-1 de NAA; Sacarosa 30gl-1 para DCR y 20gl-1 para GD; 5gl-1 de agar gel y ajustándose el pH a 5.7  0.1. Se esterilizaron a 121ºC y 1 atm. de presión durante 15 min. En este caso fueron evaluados ocho tratamientos con ocho repeticiones.

Diseño del experimento.- Se utilizó un diseño totalmente al azar y con arreglo factorial 23 factor A: explantes; factor B: medios de cultivo; factor C: concentración a los reguladores de crecimiento donde la variable dependiente a evaluar fue numero de brotes por embrión.

Inducción de yemas.- Cotiledones de embriones maduros y embriones cigóticos completos fueron colocados en los tratamientos señalados, incubándose durante seis semanas por 16/8 h-luz, a 2000 lux y 26ºC  2°C para la inducción de yemas.

Alargamiento de yemas.- Los cotiledones y embriones fueron transferidos a frascos con medio DCR ó GD sin reguladores de crecimiento y disminuyendo la sacarosa a la mitad de su concentración, en estas condiciones permanecieron por seis semanas. Al final de esta etapa se evaluó el número de yemas que presentaban al menos 2 primordios foliares bien desarrollados.

Formación de brotes.- Los explantes con yemas desarrolladas se transfirieron a los mismos medios de cultivo pero adicionados con 0.1% de carbón activado manteniéndose estos durante 8 semanas. Para esta etapa se evaluó la variable número de brotes por embrión.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN


Inducción de yemas .- Desde las primeras semanas de iniciado el cultivo los cotiledones y embriones presentaron la formación de estructuras nodulares semejantes a callos, al transcurrir seis semanas en el medio.

Alargamiento de yemas.- Se hicieron evidentes primordios de yemas después de seis semanas en los medios de cultivo. Sin embargo no se presentaron diferencias significativas para ninguno factor, los resultados se muestran en el cuadro 1. El tiempo requerido para esta respuesta coincide con lo observado en otras especies de pino (10 y 11).


Cuadro 1. Promedios obtenidos a las seis semanas en la etapa de alargamiento de yemas evaluándose el número de primordios de yemas en Pinus maximartinezii.

Explante

Medio de Cultivo

Concentración de reguladores de crecimiento mgl-1

Cotiledones

Embrión

DCR

GD

0.3

0.5

1.093a

1.375a

1.312a

1.156a

1.281a

1.187a

Formación de brotes.- Para la evaluación del número de brotes se tomaron en cuenta solamente las yemas que mostraban al menos dos primordios foliares bien desarrollados.


Cuadro 2. Número de brotes promedio de Pinus maximartinezii obtenidos a las 8 semanas en la etapa de formación de brotes.


Medio de cultivo







Concentración de reguladores de crecimiento mgl-1

DCR

GD

0.3

0.5

4.031a

2.844b

2.969a

3.906b

Literales diferentes indican DMS.
En general el medio de cultivo DCR mostró mejores resultados que el medio GD. Así mismo, al analizar la concentración de los reguladores de crecimiento se encontró mayor respuesta con 0.5mgl-1 BAP en comparación con 0.3mgl-1 (cuadro 2). No es fácil definir la causa por la cual cotiledones provenientes de un mismo embrión presentan diferencias en su respuesta, es necesario ajustar el protocolo de regeneración para cada especie de pinos. Ya que algunas especies responden exitosamente a dosis bajas de BA y otras responden mejor a dosis mayores de citocininas. (12) la respuesta observada del presente trabajo coincide con lo reportado por Niella y Rocha (8). Quienes utilizando cotiledones provistos de hipó cotilos obtuvieron una mejor respuesta con altas concentraciones de BA. Así mismo Ojeda (10) encontraron en Pinus halepensis que conforme se incrementa la concentración de BA, la respuesta de los explantes fue mayor. Por lo que, la mayoría de las regeneraciones in vitro del genero pinus a sido el resultado de la utilización de embriones maduros así como de la concentración de los reguladores de crecimiento (6,11) En general la mayor respuesta se obtuvo a partir de embriones cigóticos completos en el medio DCR utilizando 0.5mgl-1 de BAP.
BIBLIOGRAFÍA

  1. Go, N.E; G.D. Pérez-Orosco y S.C, Halos 1993. In vitro response of embryos from different provenants of pinus caribaea var, hondurensis morelet. Plant cell, tissue and organ culture 32: 1-7.

  2. Gresshoff, P.M. y C.H. Doy 1972. Development and differentiation of haploid Lycopersicon esculentun. Planta 107: 161-170.

  3. Gupta P.K. y D.J. Durzan 1985 Shoot multiplication from mature trees of Douglas fir (pseudotsuga menziesii) and sugar pine (pinus lambertiana). Plant cell Rep. 4:177-179.

  4. Ledig, F. T, T. M. Conkle, Bermejo-Velazquez, T. Eguiluz-Piedra, P.D. Hodgskiss, D.R Johnson y W. S. Dvorak.1999. Evidence for an extreme bottleneck in a rara mexican oinyon: Genetic diversity desequilibrium and the mating system in Pinus maximartinezii evolution 53 (1): 191-199.

  5. Martínez, M. 1953ª Las pináceas Mexicanas. Sec. Agric. Ganad. Subsec. Recursos Forestales y de Caza. México p.362.

  6. Martínez-Pulido C.; I.S. Harry y T.A. Thorpe 1992 Optimization of bud induction in cotyledonary explants of Pinus canariensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 29:247-255.

  7. Mata M.R.,V y M. Chávez y R. B. Boettler,. 2001. In Vitro regeneration of plantets from in mature zygotic embryos of Picea chihuahuana Martinez, an endemic Mexican endangered species. In vitro cellular y Developmental biology; Columbia. 1 (37):73-79.

  8. Niella, F. y P. Rocha. 2001. Research and Development of vegetative Propagation Techniques for Pinus sp. In the Norhteast Region of Argentina. Proceedings of the 26 Th Biennial Southern Forest Tree Improvement Conference. June 26-29, 2001. Ed: Jeffrey F.D. Dean-Georgia University, Athens, GA USA. Pp. 32-38.

  9. Norma Oficial Mexicana NOM-ECOL-059-94, que determina las especies de flora y fauna silvestres terrestres acuáticas en peligro de extinción, amenazadas, raras y las sujetas a protección especial y que establece especificaciones para su protección. Diario Oficial ( 16 de mayo de1994); 1994: 2-25.

  10. Ojeda, M. 1992. inducción de Organogénesis y Embriogénesis Somática de Pinus cembriodes y Pinus halepensis. Tesis de maestría, FA-UANL. Mty. México. 44-47.

  11. Patel, K.R. y T.A.Thorpe 1994. In vitro differentiation of planlets from embryonic explants of lodgepole pine (Pinus contorta Dougl ex loud) Plants Cell, Tissue and Organ Culture 3:131-142.

  12. Saravitz, C.H. 1990. In vitro propagation of Fraser fir (Abies fraseri) and Virginia pine (Pinus virginiana) from embryonic explants. Ph.D Dissertation. North Carolina State University. 108 pp.


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