Evaluación de proteínas relacionadas con la vía de los mirnas como biomarcadores potenciales de cáncer de mama en población zacatecana



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Evaluación de proteínas relacionadas con la vía de los miRNAs como biomarcadores potenciales de cáncer de mama en población zacatecana
L. A. Jaime-Martínez a , L. A. Ramírez-Bermejo a , J. G. Ortiz-Ramírez a, M. Sánchez-Martínez b , S. Godina-González a , J. L. Ayala-Luján a y R. A. Martínez-Orozco a.

a Unidad Académica De Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Zacatecas, Zacatecas., raptor_04@hotmail.com, luis_antoniolarb2.0@hotmail.com, lancelibra@hotmail.com, sgodina@hotmail.com, jorgeayala69@hotmail.com, rmar@uaz.edu.mx,

b Laboratorio de Anatomía Patológica, Hospital General de Zacatecas “Luz González Cosío”, Zacatecas, Zacatecas., marcoasm2013@gmail.com

RESUMEN

El cáncer de mama es la neoplasia más común en mujeres a nivel mundial y ocurre a través de un mecanismo sumamente complejo en el que una gran cantidad de funciones celulares se ven alteradas. Reportes recientes muestran una expresión aberrante de varios miRNAs en los tumores mamarios, razón por la cual es factible pensar que la maquinaria celular involucrada en la biogénesis y función de estos RNAs pequeños, pueda experimentar eventos de desregulación. En este sentido, existen varias proteínas clave para el funcionamiento y biogénesis correcta de los miRNAs, entre las que se encuentran las proteínas de la familia Argonauta y ADAR. El objetivo de nuestro estudio fue evaluar la expresión de las proteínas Argonauta 4 y ADAR1 en tumores mamarios y en tejidos normales mediante la técnica de western blot. Analizamos un total de 55 tejidos, clasificados en 4 grupos de acuerdo a su estatus tumoral (Tejido sin alteración, carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal infiltrante y carcinoma lobulillar infiltrante). Los datos obtenidos se evaluaron mediante la prueba de chi cuadrada de Pearson y encontramos que ninguna de las dos proteínas (Argonauta 4 y ADAR1) se asociaban de forma significativa al estatus tumoral. En este sentido, podemos concluir que en nuestra muestra analizada, no existe relación entre los diferentes estadios tumorales y la expresión de estas proteínas de la vía de los miRNAs.


INTRODUCCIÓN

El cáncer de mama es un problema de salud pública de suma importancia, puesto que en la actualidad es el tumor en mujeres que se diagnostica con mayor frecuencia y además es el causante del mayor número de muertes a nivel mundial. En los reportes correspondientes al año 2000, esta neoplasia ocupó el segundo lugar del total de casos nuevos de cáncer a nivel mundial, representando el 22 %; cifra que aumentó en un punto porcentual en el año 2008. Tomando como base las tasas de crecimiento de los últimos 20 años, se ha proyectado que existirán 1.4 millones de casos nuevos de cáncer de mama para el año 2010 [1-3].

En México el cáncer mamario ha desplazado al cáncer cérvicouterino como la primera causa de muerte en el sexo femenino desde al año 2006 y se ha observado un marcado incremento en la mortalidad relacionada con dicha neoplasia. Solo por citar algunos datos, para el año 2000 hubo 3432 casos de mortalidad, mientras que para el año 2007 la cifra aumentó a 4609, alrededor de un 34 % de incremento en tan solo 7 años. En lo que respecta a la edad de aparición, se tiene registrado que en el grupo de 40 a 49 años ocurren el mayor número de casos [4]. En apoyo a los datos antes mencionados, se ha reportado que en la población mexicana el mayor número de casos de cáncer mamario ocurren 10 años antes (+/- 51 años) con respecto a mujeres de Europa y Estados Unidos de América (+/- 63 años) [5].

La etiología del cáncer de mama se relaciona con la expresión aberrante de genes relacionados con procesos tales como el crecimiento celular, apoptosis, angiogénesis, invasión tisular y metástasis [6], por lo que es importante analizar los diversos factores que se relacionan directamente con la regulación genética.

En este sentido, existe una clase de RNAs pequeños no codificantes que tienen funciones de regulación de la expresión genética, denominados miRNAs. Presentan un tamaño de entre 20 y 30 nucleótidos y se unen a un complejo multiproteico denominado RISC para poder llevar a cabo su función. En términos generales, regulan la expresión génica de forma post-transcripcional, mediante la unión por enlaces de tipo Watson-Crick al RNAm blanco correspondiente. Cuando ocurre una interacción exitosa miRNA - RNAm blanco, este último pueden ser objeto de degradación mediada por exonucleasas, corte endonucleolítico o bien, la inhibición de su traducción. Se ha descrito que un tercio de los genes humanos son regulados por los miRNAs, lo que nos ratifica la importancia de estos en los procesos celulares [7].

En la biogénesis y función de los miRNAs se ven involucradas varias moléculas entre las que destacan las proteínas de las familias Argonauta y ADAR. Las proteínas Argonauta son el componente principal del complejo RISC, de tal suerte que son indispensables para que ocurra el silenciamiento mediado por los miRNAs [8]. Por su parte las proteínas ADAR son deaminasas de adenosina de RNA y convierten la adenosina en inosina, lo que promueve la modificación en la estructura de los miRNAs y por ende el potencial de silenciar RNAm específicos [9].

Por el hecho de que en cáncer de mama se han visto niveles aberrantes de miRNAs, nosotros consideramos que era factible encontrar alguna desregulación en el nivel de expresión de estas proteínas, idea de la cual se deriva el presente estudio.
TEORÍA

De acuerdo con el Programa de acción para la prevención y el control del cáncer mamario de la Secretaria de Salud, en México diariamente se registran alrededor de 10 muertes por esta neoplasia; por lo que es de suma importancia conocer a mayor detalle los procesos que conllevan a la formación de tumores. Actualmente, el diagnóstico y tratamiento del cáncer de mama se realiza primordialmente mediante estudios histopatológicos y algunos marcadores moleculares como Her2 o el receptor a estrógeno. Sin embargo, en algunos subtipos tumorales, estos estudios no proveen de información suficiente para realizar un tratamiento efectivo, de ahí la necesidad de buscar nuevos marcadores moleculares que permitan la inclusión de una mayor cantidad de fenotipos alterados, que conlleven a una mejora en el diagnóstico y tratamiento del cáncer de mama.

Por el hecho de que estudios realizados en diversas neoplasias no mamarias muestran una alteración importante en la función o expresión de las proteínas ADAR 1 y Argonuata 4, consideramos factible que exista una alteración de los niveles de estas proteínas en los tumores mamarios, razón por la cual presentan un potencial importante de uso como marcadores tumorales.

PARTE EXPERIMENTAL

Obtención de muestras


Las muestras tumorales mamarias fueron donadas por 52 pacientes que se sometieron a cirugía en el Hospital General de Zacatecas “Luz González Cosío”. Dichas muestras quirúrgicas fueron obtenidas antes del tratamiento sistémico, y la inclusión en parafina se realizó en el marco de los procedimientos de diagnóstico. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de dicho hospital (documento No. 003/2003).

Extracción de proteínas a partir de tejidos incluidos en parafina.


La extracción de proteínas totales se realizó mediante el protocolo descrito previamente por Addis y colaboradores [10], con ligeras modificaciones. Brevemente, se tomó el bloque de parafina con el tejido tumoral y se realizaron 5 cortes en microtomo de 10 µm de grosor cada uno, para posteriormente ser colocados en un microtubo y desparafinados con xileno. Una vez realizado este paso, el tejido resultante se rehidrató con una serie de etanol de diversas concentraciones para luego añadir el buffer de extracción, que contiene 20 mM de Tris - HCl, pH 8.8, SDS al 2% y DTT 200 mM. Después de la adición del buffer, las muestras fueron incubadas a altas temperaturas, una primera etapa de 20 minutos a 100 °C y posteriormente 2 horas a 80 °C en agitación constante. El extracto final se alicuotó y se almacenó a -20 °C para su análisis posterior.

Western Blot.


Las proteínas de los extractos totales fueron cargadas a volumen constante y se separaron en geles de poliacrilamida al 8% por SDS-PAGE, para después ser transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Una vez realizada la transferencia, las membranas fueron bloqueadas durante una hora con leche libre de grasa al 3% en PBS pH 7.4/0.1% de Tween 20 (PBS- Tween), seguido de la incubación a 4 °C durante toda la noche con el Ac primario correspondiente, diluido en PBS-Tween. Después de esto, las membranas fueron lavadas con PBS-Tween, para posteriormente ser incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente, con el anticuerpo secundario correspondiente. Posteriormente, las membranas fueron lavadas nuevamente y se realizó la visualización de las bandas inmunoreactivas mediante el uso de luminol. La expresión de actina fue usada como control de carga.

Análisis estadístico.

Los resultados obtenidos se clasificaron en base a la presencia o ausencia de la expresión de ADAR1 en los diversos tumores disponibles. Todos los datos fueron analizados con la prueba estadista de Chi cuadrada de Pearson. El valor que se estableció para α fue de 0.05, por lo que cualquier valor por debajo de éste se consideró estadísticamente significativo. El análisis se realizó en el programa SPSS versión 18 (IBM, Nueva York, EE.UU).
RESULTADOS

Para facilitar el análisis de los datos procedimos a clasificar las muestras tumorales de acuerdo con su perfil histopatológico. Como se muestra en la tabla 1, las muestras obtenidas presentaron 4 perfiles histopatológicos diferentes, tejido sin alteraciones, carcinoma ductal in situ, carcinoma lobulillar infiltrante y carcinoma ductal infiltrante, que representan el 12.76%, 17.02%, 6.38% y 63.82% del total de muestras respectivamente (Tabla 1).



Tabla 1: Características clínico-patológicas de las muestras tumorales.

Características

Número de elementos

%

Sin alteración

6

12.76

Carcinoma ductal in situ

8

17.02

Carcinoma lobulillar infiltrante

3

6.38

Carcinoma ductal infiltrante

30

63.82

Una vez realizada la clasificación, procedimos a la extracción de proteínas totales de las muestras tumorales colectadas y analizamos los niveles de expresión de ADAR1 y Argonauta 4. En la figura 1 se muestran auto-radiogramas representativos del análisis de expresión de ADAR1 a los diferentes extractos de los tejidos tumorales obtenidos y como se puede observar, existe una expresión diferencial de esta proteína.








ADAR1

A



B

Actina



3655 2031 2373 3255 1596 3386 442 1675 MCF-10A

Figura 1 Niveles de expresión de ADAR1 y β-actina en extractos de muestras tumorales: Extractos totales de diversas muestras tumorales fueron sometidos a Western blot para la detección de ADAR1 y -actina. Se observa la expresión diferencial de ADAR1 en las diversas muestras (A). El nivel de expresión de -actina (B) fue usado como control de carga.
La interpretación de los auto-radiogramas se realizó de manera visual, calificando como positivo a la mínima señal de expresión y negativo a la ausencia de ésta. Con base a los resultados obtenidos, procedimos a realizar una tabla de contingencias con el propósito de establecer si existía alguna relación entre el tipo tumoral de la muestra y el status de expresión de ADAR1 o Argonauta 4, mediante el análisis de Chi cuadrada de Pearson. Para esto incluimos las proporciones de las muestras que presentaban o no expresión de ambas proteínas en cada uno de los grupos analizados. Tal y como se muestra en las tablas 2 y 3 no existe una relación estadística al comparar las proporciones entre los 4 grupos de estudio con las proteínas correspondientes.
Tabla 2: Tabla de contingencias y análisis de Chi cuadrada de Pearson para Argonauta 4

Tipo de tumor

Negativo

Positivo

Carcinoma ductal in situ

5

2

Carcinoma ductal infiltrante

12

12

Carcinoma lobulillar infiltrante

2

2

Tejido sin alteración neoplásica

3

1

Prueba de Chi cuadrada de Pearson

Chi cuadrada

1.672

Dif.

3

Valor de p

0.643*



Tabla 3: Tabla de contingencias y análisis de Chi cuadrada de Pearson para ADAR1

Tipo de tumor

Negativo

Positivo

Carcinoma ductal in situ

5

3

Carcinoma ductal infiltrante

15

15

Carcinoma lobulillar infiltrante

3

0

Tejido sin alteración neoplásica

3

3

Prueba de Chi cuadrada de Pearson

Chi cuadrada

3.0

Dif.

3

Valor de p

0.3913*


CONCLUSIONES

Nuestros resultados no muestran una asociación entre la expresión de ADAR1 o Argonauta 4 y los estadios tumorales, como se encontró en otros tumores. Esto pudo ocurrir por la influencia de varios factores, entre los que destacan la cantidad limitada de muestras, ya que nuestra n fue algo reducida. Por esta razón, no tenemos la certeza de que la relación entre la expresión de ADAR y el fenotipo tumoral no existe, por lo que es necesario aumentar el número de muestras para lograr un resultado más contundente. De igual forma, es pertinente analizar los niveles de actividad de ambas enzimas, puesto que otros autores observaron diferencias en estos parámetros, más no en los niveles de expresión [11] Por lo antes descrito, consideramos importante realizar un análisis minucioso de los transcritos de las células tumorales y sus ediciones, o bien, de los niveles de expresión de otras proteínas de la vía miRNA para tratar de establecer como este mecanismo de silenciamiento génico se ve alterado en el cáncer de mama, y eventualmente proponer un nuevo marcador tumoral que permita una mejora en el diagnóstico y tratamiento del cáncer de mama.




BIBLIOGRAFÍA

[1] D. M. Parkin, "International variation," Oncogene, vol. 23, pp. 6329-40, Aug 23 2004.

[2] D. M. Parkin, et al., "Global cancer statistics, 2002," CA Cancer J Clin, vol. 55, pp. 74-108, Mar-Apr 2005.

[3] A. Jemal, et al., "Global cancer statistics," CA Cancer J Clin, vol. 61, pp. 69-90, 2011.

[4] INEGI. and Secretaría de Salud. (2007). Base de datos de defunciones 2000 - 2007, proyecciones de la población de México, 2005-2050. Available: http://sinais.salud.gob.mx/mortalidad/

[5] S. Rodriguez-Cuevas, et al., "Breast carcinoma presents a decade earlier in Mexican women than in women in the United States or European countries," Cancer, vol. 91, pp. 863-8, Feb 15 2001.

[6] D. Hanahan and R. A. Weinberg, "The hallmarks of cancer," Cell, vol. 100, pp. 57-70, Jan 7 2000.

[7] V. N. Kim, et al., "Biogenesis of small RNAs in animals," Nat Rev Mol Cell Biol, vol. 10, pp. 126-39, Feb 2009.

[8] Z. S. Kai and A. E. Pasquinelli, "MicroRNA assassins: factors that regulate the disappearance of miRNAs," Nat Struct Mol Biol, vol. 17, pp. 5-10, Jan 2010.

[9] Y. Nemlich, et al., "MicroRNA-mediated loss of ADAR1 in metastatic melanoma promotes tumor growth," J Clin Invest, vol. 123, pp. 2703-18, Jun 3 2013.

[10] M. F. Addis, et al., "Generation of high-quality protein extracts from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues," Proteomics, vol. 9, pp. 3815-23, Aug 2009.

[11] C. Cenci, et al., "Down-regulation of RNA editing in pediatric astrocytomas: ADAR2 editing activity inhibits cell migration and proliferation," J Biol Chem, vol. 283, pp. 7251-60, Mar 14 2008.





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