Experimento de Meselson y Stahl



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EL ADN SE DUPLICA DE MANERA SEMICONSERVATIVA
El experimento de Meselson y Stahl en 1958 permitió demostrar que el mecanismo real se ajusta a la hipótesis de replicación semiconservadora. Para ello se hicieron crecer células de Escherichia coli en presencia de nitrógeno-15, un isótopo del nitrógeno más pesado de lo habitual. En consecuencia, el isótopo se incorporó a las cadenas de ADN que se iban sintetizando, haciéndolas más pesadas.

LA REPLICACIÓN DEL ADN: INICIACIÓN
Los experimentos realizados por Cairns (1963) con bacterias Escherichia coli permitieron determinar la existencia de ese punto fijo u origen de replicación a partir del cual el genoma empezaba a replicarse. Los experimentos consistían en mantener un cultivo de E. coli creciendo en un medio que contenía timidina tritiada (timina marcada con tritio), de forma que el ADN quedara marcado radiactivamente pudiendo efectuarse una autorradiografía. A continuación se observaba al microscopio. Los resultados indicaban que la replicación en E. coli se iniciaba en un punto concreto (OriC).

La cantidad de ADN que se puede sintetizar a partir de un único origen de replicación se denomina replicón o unidad funcional de replicación. El genoma bacteriano es un replicón único circular. En organismos eucarióticos, la replicación del ADN se inicia en múltiples orígenes a la vez (hay uno cada 20 kb aproximadamente), es decir, hay varios replicones.


Debido a que en la célula ambas cadenas de la doble hélice de ADN se duplican al mismo tiempo, éstas deben separarse para que cada una de ellas sirva de molde para la síntesis de una nueva cadena. Por eso, la replicación avanza con una estructura en forma de horquilla formándose una burbuja u ojo de replicación


El movimiento de la horquilla es bidireccional en la mayoría de los casos, es decir, a partir de un punto se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos.

La replicación siempre se produce en sentido 5' → 3', siendo el extremo 3'-OH libre el punto a partir del cual se produce la elongación del ADN. Esto plantea un problema, y es que las cadenas tienen que crecer simultáneamente a pesar de que son antiparalelas, es decir, que cada cadena tiene el extremo 5' enfrentado con el extremo 3' de la otra cadena. Por ello, una de las cadenas debería ser sintetizada en dirección 3' → 5'.

Este problema lo resolvieron los científicos japoneses Reiji Okazaki y Tsuneko Okazaki en la década de 1960, al descubrir que una de las nuevas cadenas de ADN se sintetiza en forma de trozos cortos que, en su honor, se denominan fragmentos de Okazaki. Su longitud suele variar entre 1000 y 2000 nucleótidos en las bacterias y entre 100 y 400 nucleótidos en eucariontes.

La cadena que se sintetiza en el mismo sentido que avanza la horquilla de replicación se denomina hebra adelantada (en inglés, leading strand, que a veces se traduce por líder o conductora) y se sintetiza de forma continua por la ADN polimerasa, mientras que la que se sintetiza en sentido contrario al avance se denomina hebra rezagada o retrasada (en inglés, lagging strand), cuya síntesis se realiza de forma discontinua teniendo que esperar a que la horquilla de replicación avance para disponer de una cierta longitud de ADN molde




En el proceso general de la replicación intervienen varias moléculas y enzimas. Indica cual es la función de cada una de estas:




  • La helicasa rompe los puentes de hidrógeno de la doble hélice permitiendo el avance de la horquilla de replicación.

  • La topoisomerasa impide que el ADN se enrede debido al superenrollamiento producido por la separación de la doble hélice.

  • Las proteínas SSB se unen la hebra discontínua de ADN, impidiendo que ésta se una consigo misma.

  • La ADN polimerasa sintetiza la cadena complementaria de forma continua en la hebra adelantada y de forma discontínua en la hebra rezagada.

  • La ARN primasa sintetiza el cebador de ARN necesario para la síntesis de la cadena complementaria a la cadena rezagada.

  • La ADN ligasa une los fragmentos de Okazaki.

El proceso se puede dividir en 3 fases: iniciación, elongación y terminación.

  • El cebador: son pequeñas unidades de RNA que se unen a los fragmentos para que la ADN polimerasa reconozca donde debe unirse.

Los cebadores los quita la pol. I y coloca bases a la cadena en crecimiento por la ligasa.

LA REPLICACIÓN DEL ADN: ELONGACIÓN

En el siguiente paso, la holoenzima ADN Pol III cataliza la síntesis de las nuevas cadenas añadiendo nucleótidos sobre el molde. Esta síntesis se da bidireccionalmente desde cada origen, con dos horquillas de replicación que avanzan en sentido opuesto. Cuando el avance de dos horquillas adyacentes las lleva a encontrarse, es decir, cuando dos burbujas se tocan, se fusionan, y cuando todas se han fusionado todo el cromosoma ha quedado replicado.

Puesto que la holoenzima ADN Pol III necesita de un extremo 3'-OH libre, es necesario que una ARN primasa catalice la formación de un fragmento corto específico de ARN llamado cebador, que determinará el punto por donde la ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos. Así, durante la síntesis, en cada horquilla de replicación se van formando dos copias nuevas a partir del cebador sintetizado en cada una de las dos hebras de ADN que se separaron en la fase de iniciación, pero debido a la unidireccionalidad de la actividad polimerasa de la ADN Pol III, que sólo es capaz de sintetizar en sentido 5´ → 3', la replicación sólo puede ser continua en la hebra adelantada; en la hebra rezagada es discontinua, dando lugar a los fragmentos de Okazaki.

La mitad del dímero de la holoenzima ADN Pol III sintetiza la hebra adelantada y la otra mitad la hebra rezagada

En la hebra rezagada, cuando la ADN Pol III hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el cebador de ARN de éste es eliminado y los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado son unidos. Una vez se han juntado todos se completa la doble hélice de ADN. La eliminación de cebadores también se da en la hebra conductora, de síntesis continua, pero debido a que en ésta hay un solo cebador es un proceso que sólo tiene lugar una vez, mientras que en la hebra rezagada se dará tantas veces como fragmentos de Okazaki haya.

En la eliminación del fragmento de Okazaki (también denominado iniciador, cebador o primer) intervienen dos de enzimas: por un lado la ADN Pol I, que va eliminando el ARN con su actividad exonucleasa 5' → 3' y simultáneamente rellenando con ADN mediante su actividad polimerasa 5' → 3' (proceso denominado nick-traslation). Al final queda rotura (o "mella") entre el extremo 3'-OH libre y el fosfato 5' de la cadena sintetizada; por último, la ADN ligasa sella esa rotura catalizando la reacción de condensación entre el grupo fosfato y el OH de la desoxirribosa del nucleótido contiguo, completando el enlace fosfodiéster; para ello, es preciso hidrolizar una molécula de ATP.

Nota: diversos autores difieren en los enzimas implicados en esta etapa. Para algunos no es la propia ADN Pol I la que rellena el hueco tras eliminar el primer, sino que lo hace la ADN Pol III (la misma que polimeriza el resto de la cadena). Del mismo modo, algunos autores siguen empleando el término ribonucleasa o (RNasa) para referirse a la ADN Pol I en esta etapa, ya que hasta hace poco se desconocía que la propia ADN Pol I tenía la capacidad exonucleasa 5' → 3, y se pensaba que esto lo realizaba otro enzima, que recibía este nombre genérico.

LA REPLICACIÓN DEL ADN: TERMINACIÓN


El final de la replicación se produce cuando la ADN polimerasa III se encuentra con una secuencia de terminación. Se produce entonces el desacople de todo el replisoma y la finalización de la replicación.

Las ADN polimerasas también realizan otras funciones durante el proceso de replicación. Además de participar en la elongación, desempeñan una función correctora y reparadora gracias a su actividad exonucleasa 3', que les confiere la capacidad de degradar el ADN partiendo de un extremo de éste. Es importante que existan estos mecanismos de corrección ya que de lo contrario los errores producidos durante la copia del ADN darían lugar a mutaciones.



TRANSCRIPCIÓN: INICIACIÓN
En el caso de las eucariotas, el proceso se realiza en el núcleo, y es similar al de las procariotas, pero de mayor complejidad. Diferentes ARNpolimerasas transcriben distintos tipos de genes. La ARNpol II transcribe los pre-ARNm, mientras que la ARNpol I y ARNpol III transcriben los ARN-ribosomales y ARNt, respectivamente. El pre-ARNm sufre un proceso de maduración que tras cortes y empalmes sucesivos elimina ciertos segmentos del ADN llamados los intrones para producir el ARNm final. Durante este proceso de maduración se puede dar lugar a diferentes moléculas de ARN, en función de diversos reguladores. Así pues, un mismo gen o secuencia de ADN, puede dar lugar a diferentes moléculas de ARNm y por tanto, producir diferentes proteínas.
Al contrario de la replicación de ADN, durante el inicio de la transcripción no se requiere la presencia de un cebador para sintetizar la nueva cadena, de ARN en este caso. Antes del inicio de la transcripción se necesitan toda una serie de factores de iniciación de la transcripción. Estos se unen a secuencias específicas de ADN para reconocer el sitio donde la transcripción ha de comenzar y se sintetice el ARN cebador. Esta secuencia de ADN en la que se ensamblan los complejos de transcripción se llama promotor. Los promotores se localizan en los extremos 5'-terminales de los genes, antes del comienzo del gen, y a ellos se unen los factores de transcripción mediante fuerzas de Van der Waals y enlaces de hidrógeno. Los promotores suelen tener secuencias definidas, muy conservadas en cada especie. Las más conocidas TATA (la llamada caja TATA situada sobre la región –10, o sea a 10 pares de bases antes de empezar la transcripción) y la caja TTGACA (situada en el punto -35). Sobre el promotor TATA se forma el núcleo del complejo de iniciación y se fija una proteína de unión, unos factores de transcripción, una helicasa y una ARN polimerasa cuando todo está junto da comienzo la iniciación.
Primero, una Helicasa separa las hebras de ADN en estas denominadas cajas TATA, ya que entre adenina y timina se establecen dos enlaces de hidrógeno, mientras que entre citosina y guanina se forman tres. Cuando se forma el complejo abierto, la ARN polimerasa comienza a unir ribonucleótidos mediante enlaces fosfodiéster, y una vez que se forma el primer enlace fosfodiéster, acaba la etapa de iniciación y comienza así la siguiente etapa.
TRANSCRIPCIÓN: ELONGACIÓN
El centro activo de la ARN polimerasa reconoce a los ribonucleótidos trifosfato entrantes. Cuando el nucleótido entrante forma los enlaces de hidrógeno idóneos, entonces la ARN polimerasa cataliza la formación del enlace fosfodiéster que corresponde.
TRANSCRIPCIÓN: TERMINACIÓN
La terminación está señalizada por secuencias del ADN ricas en guanina y citosina, seguidas de timina, formando secuencias palindrómicas, que cuando se transcriben el ARN recién sintetizado adopta una estructura en horquilla que desestabiliza el complejo ARN-ADN, obligando a separarse de la ARN polimerasa.

Algunas secuencias poseen una secuencia a la que se unen una serie de proteínas reguladoras específicas de la terminación de la transcripción como la proteína rho .

MADURACIÓN DEL ARN
Particularmente común en las células eucariotas, el procesamiento del ARN más común es el empalme para eliminar los intrones. Los intrones son segmentos de ARN que no se encuentran en el ARN maduro y no deben formar parte de la traducción posterior.
EXPORTACIÓN DEL ARN AL CITOPLASMA
Para la exportación del ARN al citoplasma y como parte de la maduración del tránsito de sufre dos modificaciones en sus extremos:

Adición al extremo 5' de caperuza o casquete: (o CAP, su nombre en inglés) que es un nucleótido modificado de guanina. Esta caperuza es necesaria para ser reconocido y exportado el tránscrito así como para permitir el correcto reconocimiento por el ribosoma.

Poliadenilación: es la adición al extremo 3' de una cola poli-A, es decir, un tramo de unas 200 ARN adeninas que protege al ARNm frente a la degradación frente a ribonucleasas, aumentando su vida media en el citosol, de modo que se puede sintetizar mayor cantidad de proteína.
CÓDIGO GENÉTICO
El código genético es un conjunto de normas por las que la información codificada en el material genético (secuencias de ADN o ARN) se traduce en proteínas (secuencias de aminoácidos) en las células vivas. El código define la relación entre secuencias de tres nucleótidos, llamadas codones, y aminoácidos, proporcionados por ARNt activados con un anticodón complementario al codón del ARNm. El ribosoma es la estructura celular que propicia la unión anticodón y codón para la polimerización del polipéptido de acuerdo con la secuenciación de tripletes codón del tránscrito del gen.


La secuencia de bases del ácido nucléico consta de cuatro bases para las cuales debe encontrarse combinaciones para generar los 20 aa constituyentes de las proteínas. De uno en uno generamos cuatro posibilidades, cogidos de dos en dos serían 42=16 probabilidades, insuficientes. Cogidos de tres en tres las posibilidades son 43=64.

El hecho de que se generen más posibilidades que aminoácidos posibles nos proporciona un código conocido como código degenerado en el que más de un triplete nos codificará para el mismo aminoácido.

El código genético es degenerado.

El código genético es universal (común a todos los seres vivos)

Este código codifica 61 aa entre los cuales está el aminoácido de inicio común en procariotas AUG que es la formilmetionina. Los otros tres codones no corresponden a ningún ARNt activado sino que corresponden a tripletes sin sentido que finalizan la traducción del péptido. Estos son UAA, UAG, UGA.
TRADUCCIÓN
En la traducción, el ARN mensajero se decodifica para producir un polipéptido específico de acuerdo con las reglas especificadas por el código genético. Es el proceso que convierte una secuencia de ARNm en una cadena de aminoácidos para formar una proteína. El proceso de traducción tiene cuatro fases: activación, iniciación, elongación y terminación (entre todos describen el crecimiento de la cadena de aminoácidos, o polipéptido, que es el producto de la traducción).
TRADUCCIÓN: ACTIVACIÓN
En la activación, el aminoácido (AA) correcto se une al ARN de transferencia (ARNt) correcto. Aunque técnicamente esto no es un paso de la traducción, es necesario para que se produzca la traducción. El AA se une por su grupo carboxilo con el OH 3' del ARNt mediante un enlace de tipo éster (OH 3'ACC5’). Cuando el ARNt está enlazado con un aminoácido, se dice que está "cargado".

El enzima encargado de la unión de los aminoácidos con los 3’ARNt específico del correspondiente anticodón es la aminoacil-ARNt-sintetasa que requiere un ATP para su acción.




TRADUCCIÓN: INICIACIÓN (PROCARIOTAS)
La iniciación de la traducción en las procariotas supone ensamblar los componentes del sistema de traducción, que son: las dos subunidades ribosomales, el ARNm a traducir, el primer aminoacil-ARNt (el ARNt cargado con el primer aminoácido), GTP (como fuente de energía) y factores de iniciación que ayudan a ensamblar el sistema de iniciación.
El ribosoma consta de tres sitios: el sitio A, el sitio P y el sitio E. El sitio A es el punto de entrada para el aminoacil-ARNt (excepto para el primer aminoacil-ARNt, fermilmetionina-ARNt, que entra en el sitio P). El sitio P es donde se forma el peptidil-ARNt. Y el sitio E es el sitio de salida del ARNt una vez descargado tras ofrecer su aminoácido a la cadena peptídica en crecimiento.

La iniciación de la traducción en procariotas comienza con las subunidades 50s y 30s sin asociar.

El ARNr 16s de la subunidad ribosómica pequeña 30S reconoce el sitio de acoplamiento ribosómico del ARNm mediante una secuencia especial. (la secuencia Shine-Dalgarno, 5-10 pares de bases por delante del codón de iniciación AUG).

El IF-2 es una GTPasa pequeña que se asocia con el fmet-ARNt y le ayuda a acoplarse con la subunidad ribosómica pequeña.

El IF-1 (factor de iniciación 1) bloquea el sitio A para asegurar que el fMet-ARNt sólo se puede acoplar al sitio P.

El IF-3 bloquea el sitio E y evita que las dos subunidades del ribosoma se asocien aún.

La hidrólisis del GTP asociado al IF-2 y a la formilmetionina-ARNt permite la unión de la unidad 50s a la 30s en la que está el ARN y el fmet-ARNt.

TRADUCCIÓN: ELONGACIÓN (PROCARIOTAS)


Cuando se acoplan las subunidades del ribosoma se sueltan los factores de iniciación y dejan libre el sitio P que es ocupado por un aminoacil-ARNt al que se le ha unido un factor de elongación dependiente de GTP.
El aminoácido del ARNt que está en el sitio P se transfiere al sitio A donde queda unido al aminoácido de este ARNt mediante enlace peptídico.
En el siguiente paso el ribosoma se trasloca tres nucleótidos en dirección 3’ del ARNm.
El sitio A queda libre, el ARNt ahora con dos aminoácidos ocupa el sitio P en el ribosoma y el ARNt descargado (sin aa) pasa al sitio E para ser expulsado. En este proceso se gasta un GTP.
Este proceso se continúa mediante entradas sucesivas de ARNt cargados con anticodón complementario al codón del ARNm al sitio A y la polimerización del péptido en el sitio P.
TRADUCCIÓN: TERMINACIÓN (PROCARIOTAS)
Diversos factores de terminación se unen a secuencias específicas que no son complementarias con ningún anticodón de ningún ARNt.
Estas secuencias en el ARNm corresponden a los codones UAA, UAG, UGA.
Cuando aparecen estos tripletes sin sentido o tripletes stop, por medio de factores de liberación, se abre el ribosoma con gasto de ATP y quedan libres las subunidades del ribosoma, el ARNm y se hidroliza el enlace éster del péptido con el ARNt del último aa incorporado dejando libre el polipéptido completo.

DEL ADN A LAS PROTEÍNAS


El dogma central de la biología se ha completado en los últimos tiempos a raíz de encontrar en ciertos tipos de virus la capacidad de transcribir de ARN a ADN mediante un enzima, la transcriptasa inversa o retrotranscriptasa. También se ha observado la capacidad de algunos para replicar su propia molécula de ARN. Así se modifica en parte este dogma central que queda de la siguiente manera:



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