Introducción El adn complementario (adnc) es una copia de adn sintetizado a partir de arnm. Durante la reacción se utiliza la enzima transcriptasa inversa. La transcriptasa inversa es una polimerasa de adn dependiente de arn



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introducción

El ADN complementario (ADNc) es una copia de ADN sintetizado a partir de ARNm. Durante la reacción se utiliza la enzima transcriptasa inversa. La transcriptasa inversa es una polimerasa de ADN dependiente de ARN. La enzima no puede iniciar la síntesis de ADN sin un molde de ARN al que se unira una secuencia de ARNm de hebra única. El experimento de síntesis de ADNc debe realizarse en hielo.






Materiales para la síntesis de ADNc
plantilla de ARN

Primer mix

RNasa libre de agua

 tampón de reacción

inhibidor de RNasa

dNTP mix

La transcriptasa inversa


Método para la Síntesis de ADNc

 Añadir 1 μl de cebador oligodT a la plantilla de ARN (0,1 ng a 5 μg)

Añadir RNasa libre de agua hasta completar los 12 μl de volumen final

 Agitar los componentes en el Vortex y centrifugar

 Incubar la mezcla a 65 ° C durante 5 minutos

 Se coloca el tubo en hielo inmediatamente después de la incubación

 Añadir 4 μl de tampón de reacción

 Añadir 1 μl de inhibidor de RNasa

 Añadir 2 μl de dNTPs

 Añadir 1 μl de enzima transcriptasa reversa

 El volumen total debe ser de 20 mL.

 Pipetear cuidadosamente la mezcla y centrifugar brevemente

 Incubar a 42 ° C durante 60 minutos

 A continuación, se incuba a 70 ° C durante 5 minutos para terminar la reacción.



Amplificación de la cadena simple de ADNc mediante PCR

Mezclar los componentes siguientes:

2 μl de producto de reacción

 5 μl de tampón de PCR

 1 μl del dNTP mix

 3 l MgCl2

 1,5 μl de cebador directo

 1,5 μl cebador inverso

 0,5 μl de Taq polimerasa

 35,5 μl de nucleasa libre de agua

 El volumen total es de 50 μl.



Realizar PCR en el ciclo térmico en las siguientes condiciones:
Primera desnaturalización: ....... 94 ° C ................ 3 '

Desnaturalización .............. 94 ° C ................ 30''

Recocido: ................ 58 ° C ................ 30'' 35 ciclos

Extensión: ................ 72 ° C ................ 45''


Cargar el producto de PCR en gel de agarosa al 1% y realizar la electroforesis. Mediante el uso de marcador apropiado comparar y cuantificar el producto de ADNc.





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