La clonación humana y sus aspectos. Por: Jesús Guadalupe Ricardo Serrato González



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LA CLONACIÓN HUMANA Y SUS ASPECTOS.


Por:

Jesús Guadalupe Ricardo Serrato González.

ÍNDICE.
Aspectos científicos de la clonación.

Clonación en Biología. Definición de clonación.

Clonación en Animales.

Clonación en Anfibios.

Clonación en Mamíferos

Clonación en Humanos.

Estadios iniciales del desarrollo embrionario. El embrión antes del

día 14


Posibles aplicaciones de la clonación.

Clonación reproductiva como técnica de reproducción asistida.


Aspectos éticos de la Clonación.

Bioética y libertad de investigación.

Religiones y clonación.

Resumen.

Conclusiones.

Bibliografía.

Aspectos científicos de la clonación.

Clonación en Biología. Definición de clonación.

La clonación en biología existe de forma natural en la reproducción asexual de

plantas, en la formación de gemelos idénticos y en la multiplicación de las células para

reparar tejidos dañados en procesos naturales de curación. Las técnicas de clonación en

plantas se han extendido a lo largo de los siglos en jardinería y horticultura utilizando

esquejes de las plantas que se cultivaban. De hecho, el que un esqueje se desarrolle hasta

convertirse en una planta completa implica que al menos algunas de sus células son

totipotentes o si quiera pluripotentes. La clonación a partir de células cultivadas es

actualmente una técnica empleada en horticultura experimental y tiene gran importancia

desde el punto de vista comercial, como es el caso de la palmera de aceite que de forma

natural no se reproduce asexualmente. Por otra parte, en vertebrados inferiores tales como la

lombriz de tierra también se produce la clonación, ya que si ésta se divide por la mitad

dará lugar a dos individuos genéticamente idénticos. La clonación también se ha conseguido

a partir de técnicas utilizadas en laboratorio. De esta manera, es posible clonar el ADN, las

células, los tejidos, los órganos e incluso un individuo completo. La transferencia nuclear

1(actualmente conocida como transferencia nuclear de células somáticas) se comenzó a

desarrollar en la década de los cincuenta del siglo XX. Sólo a partir de los años ochenta

dicha técnica tuvo éxito en mamíferos y actualmente ha sido realizada satisfactoriamente en

ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, vacas , conejos, gatos y ciervos. En monos del género

Rhesus han sido clonados embriones mediante técnicas de gemelación (splitting) (véase la

tabla más adelante en las páginas 35 y 36).

1 La transferencia de núcleos significa la transferencia de dichos núcleos diploides de células somáticas a

ovocitos femeninos que han sido previamente enucleados.
En este contexto, es importante resaltar que la clonación no implica necesariamente

la replicación de un individuo completo. Sin embargo, la opinión pública tiende a tener una

percepción confusa en torno a este término. Para la AHEC2, la clonación la define como ‘la

propagación asexual sin producirse la alteración del genoma existente en el núcleo celular’.

No obstante la AHEC diferencia entre los procedimientos realizados para clonar un ser

humano por completo y la copia de ADN y células de un ser humano.3 En conclusión,

existen distintas definiciones al respecto diferenciando explícitamente la clonación de un ser

humano de la clonación de células y de tejidos humanos.

Por otra parte, hay diversas formas a la hora de definir el concepto de clon, así para

la Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales4, clon es un ‘ grupo de

organismos de idéntica constitución genética que proceden de un único individuo mediante

multiplicación asexual, partenogénesis o apomixis’. Por otra parte, el término clon procede

del griego que significa esqueje o retoño. Una definición más precisa a dicho término es la

siguiente: ‘individuo o grupo de individuos de idéntica constitución genética nuclear que

proceden de un único individuo mediante multiplicación asexual, siendo fenotípicamente

muy semejantes al individuo del que derivan’5 Normalmente, se han agrupado dentro de la

categoría de ‘clones’ a individuos generados bien por partición de embriones6, bien por

transferencia de núcleos. No obstante, el término de clon resulta ser un poco ambiguo y es

por ello que las definiciones resultan imprecisas o inadecuadas cuando se quiere relacionar

este término con los procesos de clonación de animales domésticos y de seres humanos ya

que se quiere mostrar una definición más exacta desde el punto de vista bioético.

En este sentido, el Roslin Institute7 destaca una serie de definiciones respecto al

concepto de clon (por otra parte, dependiendo de la antigüedad del diccionario, la definición

de clonación desde el punto de vista biológico puede variar):

- ‘Un grupo de individuos genéticamente idénticos que descienden de un mismo

progenitor mediante reproducción asexual’. Es el caso de muchas especies de

herbáceas que se reproducen por estolones además de por semillas sexuales.

- ‘Un grupo de células genéticamente idénticas que se forman por división

mitótica a partir de una célula original’. Aquí se refiere al caso de una célula

que genera un nuevo juego de cromosomas y que posteriormente se escinde

originando dos células hijas.

- ‘Un grupo de moléculas de ADN procedentes de una secuencia original de

ADN y creadas por una bacteria o virus a partir de una hebra de ADN,

empleando las técnicas de Biología Molecular’. Este es el caso de la clonación

del ADN o clonación molecular.

- ‘La producción de individuos genéticamente idénticos mediante la escisión

embrionaria’.

- ‘La producción de un clon, en el sentido de considerarse genéticamente

idéntico, se produce mediante la transferencia del núcleo de una célula somática

a ovocitos, óvulos, o cigotos enucleados’. Esta es la llamada la Transferencia

Nuclear ( Nuclear Transfer) o también llamada Cell Nuclear Replacement (CNR). Este es el caso de la oveja Dolly, donde se han empleado núcleos de

células diferenciadas de glándula mamaria. La aplicación de dicha técnica en

ratones se basa en utilizar núcleos de células de la capa celular que rodea al

óvulo. En este contexto hay que tener en cuenta que los clones producidos por

transferencia de núcleos no son directamente comparables a los clones que se

producen por escisión embrionaria ya sea de forma artificial como natural ( es

el caso de gemelos idénticos). En este sentido, Dolly no fue una copia idéntica

de la ‘madre’ que donó el núcleo ya que no hay que olvidar que el óvulo

contiene ADN procedente de la mitocondria. En definitiva, el ADN no contiene

un programa unívoco de instrucciones, sino que es flexible, y la expresión

genética en cada individuo queda matizada por multitud de factores presentes

en el citoplasma del óvulo, así como también por los procesos de formación del

embrión/feto que a su vez son sometidos al ambiente uterino hasta llegar a la

vida extrauterina (estímulos al nacer, periodo de lactancia, interacciones

sociales’ con otros individuos de la especie, etc).



En conclusión, el término de clonación implica la formación de copias genéticas que

pueden ser hebras de ADN, células en cultivo o bien individuos completos. Es decir, hay

que diferenciar el uso de la palabra clonación en Biología; por una parte si se refiere al

ámbito de la Ingeniería Genética, donde clonar significa aislar y multiplicar en un tubo de

ensayo un gen o , en general, un fragmento de ADN. Así la oveja Dolly no fue un producto

de Ingeniería Genética. Y por otra parte, en el contexto al que aquí se hace referencia, el

término clonar es obtener uno o varios individuos a partir de una célula somática o de un

núcleo de otro individuo, de modo que los individuos clonados son idénticos o casi idénticos

al original.
Por otro lado, teniendo en cuenta la primera definición del Roslin Institute Online,

la cuestión fundamental es preguntarse a qué se debe que la reproducción sexual sea la

forma predominante en la naturaleza si un individuo que se reproduce de forma asexual

transmite todos sus genes a cada uno de los miembros de su progenie, mientras que un

organismo cuando se reproduce sexualmente sólo transmite la mitad de sus genes a cada uno

de ellos. La explicación posible podría ser que en la reproducción sexual daría lugar a una

generación continua de variabilidad genética y también se evitaría la acumulación de

mutaciones deletéreas que podrían llevar a la extinción en linajes asexuales. Además en la

reproducción sexual al producirse la fecundación de los gametos surge un nuevo ser vivo

cuya dotación genética es única y diferente a la de sus progenitores, cosa que no ocurre en la

reproducción asexual. Es precisamente esa peculiar composición cromosómica de las células

sexuales y el resultado de su unión lo que hace que los seres engendrados sexualmente sean

siempre genéticamente distintos a sus progenitores. Los seres vivos más complejos se

reproducen de forma sexual, por la que dos células germinales (óvulo y espermatozoide) se

unen, formando un cigoto (huevo), que se desarrollará hasta dar un individuo adulto. La

reproducción sexual garantiza que en cada generación de una especie aparezcan nuevas

combinaciones de genes en la descendencia, que posteriormente será sometida a la selección

y a otros mecanismos evolutivos. Por tanto, la reproducción sexual provoca una gran

variabilidad entre los individuos de cada especie. No obstante, estas especies que

constituyen una población no presentan la estabilidad genética con respecto a aquellas que

se reproducen de forma asexual. Es precisamente por esto último por lo que se intenta

clonar animales o incluso seres humanos con el único fin de conseguir seres idénticos que

por las razones que sean se les considera valioso replicar. En la naturaleza, se observa que la

reproducción asexual es bastante corriente, casi prácticamente igual a la sexual. Por otro lado, la reproducción asexual suele significar, en la mayoría de los casos, la clonación. No

obstante, los mamíferos utilizan la replicación asexual de forma poco corriente, así el

embrión se divide a veces en el útero para dar lugar a gemelos idénticos, siendo cada uno de

ellos un clon del otro. Además es interesante resaltar como una posible justificación a la

clonación humana que en principio dos individuos clónicos tienen menor grado de identidad

entre sí que los gemelos monocigóticos porque en los individuos clónicos los citoplasmas de

sus células son diferentes y además por lo mencionado anteriormente, porque no han

compartido un ambiente intrauterino común. La obtención de embriones gemelos por

bisección o por separación de blastómeros (gemelación artificial) se viene haciendo desde

hace años para la obtención de mamíferos de laboratorio o bien en especies ganaderas. El

proceso de división gemelar consiste en tomar un embrión en la fase en la que todas sus

células son aún totipotentes (es aproximadamente en los dos primeros días después de la

fecundación) es decir en la fase de mórula provocando la división celular. Cada una de estas

divisiones da lugar a un ser con un código genético que es idéntico al de los demás seres que

resultan de esa división.




Clonación en animales.
La clonación (la formación de un grupo de individuos con el mismo genotipo

mediante reproducción asexual) en animales se puede encontrar en invertebrados marinos

tales como en las hidras, las anémonas de mar, las estrellas de mar (por regeneración) y en

las planarias (por escisión). Además de encontrarse en los anélidos. En el caso de la estrella

de mar es posible la regeneración de todo un individuo completo a partir de un fragmento

(grande) de ésta. La regeneración es un proceso reproductivo por medio del cual el organismo se

reconstruye ante la pérdida de una parte de éste. El organismo posee células

‘reconstructoras’ que forman la parte que falta del mismo. Por tanto, la clonación natural en

animales se considera un proceso de reproducción asexual como ya se ha mencionado

anteriormente. En la reproducción asexual (clonación) se produce un individuo

genéticamente idéntico a su progenitor. No obstante, la clonación de animales no es tan

común como en las plantas, quizá porque el tejido animal es menos propenso a retener

células totipotentes. El tejido cicatrizante por el cual los animales cierran sus heridas no se

puede comparar al tejido calloso de las plantas. En definitiva, las plantas parecen más

proclives que los animales a retener células totipotentes a lo largo de toda su vida.
Clonación en anfibios.
A finales del siglo XIX, en concreto en 1985, Weismann enunció una teoría para

explicar el desarrollo de los seres vivos. Según este científico, en cada división celular, las

células que nacen tendrían menor información que las que las generan. Más tarde, se

comprobó que dicha teoría no era correcta.

Lo cierto es que con la clonación se demuestra que por mucho que esté diferenciada

una célula , dicha célula presenta igual información genética que el cigoto unicelular recién

formado tras la fecundación.

Spemann (1938)8 fue el que enunció la teoría de que el núcleo de una célula

somática podría ser transferido a un cigoto una vez que el material genético del cigoto fuese

eliminado. Este investigador propuso la transferencia nuclear en embriología para estudiar

el papel que realizaban el núcleo y el citoplasma en el control de los primeros estadios del desarrollo embrionario. Sin embargo, los mayores logros con relación a la clonación en

animales vertebrados se remontan a la década de los 50 del siglo pasado cuando se

realizaron los primeros experimentos de clonación en anfibios por transferencia nuclear.

Dichas investigaciones fueron llevadas a cabo por Briggs y King (1952-1957)9 en Rana



pipiens y posteriormente otras investigaciones fueron realizadas en 1967 por Di Berardino y

King10 . Los estudios realizados por Briggs y King consistieron en transferir núcleos de

células de blástula, gástrula, néurula y renacuajo a citoplasmas de óvulos sin fecundar.

Dichos óvulos habían sido previamente enucleados11 por medio de técnicas de

micromanipulación. Posteriormente, comprobaron que dichos núcleos podían volver a

originar un desarrollo normal. Briggs y King establecieron que un número significativo de

óvulos enucleados podían desarrollar embriones e incluso renacuajos. De esta manera, de

los 197 embriones reconstruidos, 104 iniciaron su desarrollo, 35 se convirtieron en

embriones y 27 llegaron a renacuajos. Brigs y King demostraron que los núcleos de células

de blástula que habían superado la etapa bicelular o tetracelular retenían la totipotencia,

como podía comprobarse al situarlos en un adecuado entorno citoplásmico. Por tanto, habían

logrado los primeros clones por el método de transferencia nuclear (dicho método es

científicamente diferente y más avanzado que la simple escisión de embriones). En

conclusión, observaron que el desarrollo se completaba con normalidad pero que disminuía

paulatinamente su capacidad de desarrollo normal si se utilizaban núcleos procedentes de

estadios más avanzados (se perdía su totipotencia). Así por ejemplo observaron que el núcleo que procedía de células de néurula (aproximadamente con dos días de desarrollo

embrionario) no progresaba normalmente. Estos resultados les llevaron a la conclusión de

que en el desarrollo y en la diferenciación celular existe una pérdida o inactividad de los

genes.

En este sentido, las experiencias realizadas por el equipo de investigación británico



liderado por Michael Fischberg en la década de los sesenta fueron con una rana africana de

uñas procedente de Sudáfrica llamada Xenopus laevis. Decidieron utilizar dicha especie por

dos razones: la primera porque alcanzaba fácilmente la madurez sexual en laboratorio y la

segunda razón era porque Xenopus podía poner huevos durante todo el año inyectándole

determinadas hormonas de mamíferos. Por tanto, Xenopus se convirtió en el material de

laboratorio idóneo para realizar la técnica de transferencia nuclear12. Además dicha especie

se utilizó como marcador genético para probar que la transferencia nuclear del embrión

procedía del núcleo transplantado (Fischberg, Gurdon y Elsdale 1958). Más tarde, las

experiencias realizadas por Gurdon ( 1960, 1962)13 con Xenopus laevis, llegaron a

demostrar que las conclusiones realizadas por Briggs y King con Rana pipiens no eran

correctas, ya que obtuvieron un macho y una hembra adultos normales transplantando

núcleos de células diferenciadas ( en concreto en las células ciliadas del epitelio intestinal)

de renacuajo a citoplasma de óvulos enucleados mediante radiación ultravioleta. Con estos

resultados, se establecía que la diferenciación celular se establecía sin producirse una

inactividad o pérdida irreversible del material genético. Así por ejemplo, el núcleo de una

célula intestinal tendría los genes inactivados para el músculo, el cerebro; no obstante, estos

genes podrían ser ‘reprogramados’ cuando dicho núcleo fuese transferido a una célula enucleada. Con estas investigaciones se comprobaba que la teoría de Weismann era

incorrecta, es decir no había pérdida de material genético al utilizar células diferenciadas.

Es importante resaltar que en los experimentos antes mencionados, los núcleos

transplantados procedían de células diferenciadas de renacuajos, éstos no son individuos

adultos sino estadios intermedios en la metamorfosis del anfibio.14

En experiencias posteriores, se utilizaron núcleos procedentes de las células de

renacuajos albinos los cuales fueron transplantados a ovocitos enucleados de renacuajos

del tipo silvestre (no albino). Se obtuvieron embriones clonados de renacuajos que eran

albinos, ya que dichos embriones procedían de núcleos donadores del tipo albino. En este

contexto, se llevó a cabo el procedimiento denominado transferencia nuclear en serie (serial



nuclear transplantation). Dicho procedimiento implicaba el realizar transplante del núcleo a

partir de células embrionarias a un ovocito enucleado para posteriormente dejarlo crecer

hasta las fases tempranas del desarrollo embrionario. Dicha técnica pudo ser realizada

indefinidamente. El objetivo fundamental de la serial nuclear transplantation15 era producir

un gran número de individuos genéticamente idénticos, es decir incrementar la eficiencia en

la clonación debido a una doble exposición en el citoplasma del ovocito y también debido a

que la transferencia nuclear se realizaba a partir de células embrionarias y no mediante

células somáticas diferenciadas que eran más complicadas de clonar.

De cualquier manera, Gurdon obtuvo ranas adultas por completo funcionales a partir

de células especializadas de renacuajos, pero jamás consiguió obtener ranas adultas de

células transferidas de células adultas. De hecho, hasta ahora todos los trabajos realizados

presentan una limitación obvia, es decir no se han conseguido obtener individuos normales por medio de transplantes de núcleos de células diferenciadas procedentes de anfibios

adultos.
Clonación en mamíferos.
La clonación en mamíferos abarca dos campos diferentes que son por un lado la

partición o división de embriones y por otro la transferencia nuclear que es la más reciente.

La escisión o división de embriones consiste en la separación de blastómeros de un embrión

en dos o más. Los productos que se obtienen pueden sobrevivir tras su separación y se

desarrollan genéticamente como individuos iguales entre sí pero diferentes a sus

progenitores. En el segundo caso, el núcleo de una célula somática se transfiere a otra

célula (ovocito, óvulo o cigoto) en la cual ha sido eliminado previamente su material

genético.

Por otra parte hay que destacar que las cualidades de los anfibios, que los hacen ser

un material ideal de trabajo, no son decididamente las mismas que en los mamíferos. Así

por ejemplo, los óvulos de mamífero son mucho más pequeños que los de anfibio. En este

sentido, los óvulos de anfibio tienen un diámetro de 1200 a 1500 micras y los de mamíferos

presentan un diámetro de sólo unas 100 micras. Esto último, unido a que en los mamíferos

la fecundación es interna, ha hecho que para estudiar la reproducción y el desarrollo inicial

de los mamíferos, los biólogos tuvieran que desarrollar una serie de técnicas tales como

hallar medios mejores de explorar interiormente la reproducción de los mamíferos.

El primer intento fallido de clonar mamíferos, en concreto conejos, mediante

transferencia nuclear de células somáticas fue realizado por Derek Bromhall16 en 1975.

Bromhall fusionó células embrionarias de los primeras fases del desarrollo con óvulos no

fecundados y enucleados de conejo utilizando microinyección y con el virus Sendai. Los óvulos no fecundados fueron obtenidos de las trompas de Falopio de hembras de conejo que

previamente habían sido inducidas a la ovulación mediante una inyección intravenosa de

gonadotropina coriónica. La técnica de fusión mediante el virus Sendai requería que en el

óvulo se eliminase la zona pelúcida del mismo. La presencia del virus Sendai produjo la

fusión del núcleo transferido y de la célula enucleada. El embrión clonado resultante murió

en las primeras etapas del desarrollo embrionario. No obstante, Bronhall llegó a la

conclusión de que con la ‘fecundación’ de un óvulo mediante la transferencia nuclear el

denominado ‘cigoto’ era capaz de poderse dividir normalmente hasta la fase de mórula. Por

tanto, la prueba por la cual se pudiera desarrollar un embrión procedente del núcleo de una

célula somática fuera transferido a un óvulo enucleado de un conejo no fue demostrada.

Sin embargo, no fue hasta 1981 cuando se anunció la primera clonación de

mamíferos con éxito por medio de transferencia nuclear. Se clonaron tres ratones con células

de embriones de ratones. Los experimentos fueron realizados por los investigadores

Illmensee y Hoppe 17 en la Universidad de Ginebra. Utilizaron los núcleos de las células de

la masa celular interna (MCI) del blastocisto18 que son totipotentes. Publicaron sus

investigaciones en Cell (1981). En el texto de Cell, Illmesee y Hoppe indicaban que los

ratones eran seres ideales para el estudio de la clonación. Argumentaban que la clonación

constituía un problema relacionado tanto con el desarrollo como con la genética ya que el

desarrollo suponía la diferenciación de células que exigen de los genes del programa

genético una intervención secuencial. Por otra parte, señalaban en dicho artículo que los

anfibios eran excelentes para estudiar el desarrollo debido a que sus huevos son grandes y robustos sin embargo su genética se conocía poco y además presentaban ciclos vitales

bastante largos. Esto provocaría un periodo de tiempo considerable en el estudio de sus

pautas de herencia para obtener conocimientos sobre sus genes. Por ello, dichos autores

señalaban que los ratones eran ideales para realizar técnicas de clonación porque

presentaban intervalos generacionales breves (son fértiles a las diez semanas) y además se

conocía bien su genética. Por tanto, los ratones los aceptaban como modelos naturales para

estudiar el desarrollo y la fisiología de los mamíferos.

La técnica se basaba en inyectar con una micropipeta los núcleos de las MCI de los

blastocistos en el citoplasma de óvulos fecundados a los que extraerían por succión los

pronúcleos masculino y femenino después de una inyección nuclear utilizando la misma

micropipeta. De esta manera sólo necesitaban clavar una vez la pipeta en su citoplasto y

provocar únicamente una herida. Por otra parte, utilizaron la citocalasina B (que es

producida por un moho) que inhibe la replicación de las moléculas de proteínas que

constituyen el citoesqueleto (red fibrosa que sostiene el citoplasma). Para Illmensee y Hoppe

la citocalasina B mejoraba la tasa de supervivencia de los óvulos que eran inyectados. En

1981, resultó una técnica nueva que posteriormente fue utilizada en el Instituto Roslin como

ya se ha citado anteriormente. Por otra parte, los donantes nucleares empleados en este

procedimiento fueron dos cepas de ratones: una gris (raza LT) y otra de piel parda y

moteada (cepa CBA). Los citoplastos receptores eran cigotos enucleados que habían sido

extraídos de un ratón negro (cepa C57B1). De esta manera, Illmensee y Hoppe demostraron

la clara diferencia de potencial entre las células de MCI (masa celular interna) y las de TE

(trofectodermo). Se desarrollaron técnicas concretas de enucleación y de fusión celular. Sin

embargo, otros científicos no consiguieron reproducir los resultados de dichos autores. Este

procedimiento fue puesto en duda en su momento por algunos científicos indicando que existían ciertas irregularidades en el protocolo experimental. De hecho, en 1984 Davor

Solter publicó un artículo en Science ( J. McGrath y D. Solter , 1984) en el que demostraba

que existían una serie de resultados negativos al respecto y concluyó que la clonación de

mamíferos por transferencia era biológicamente imposible. Por su parte, Mc Grath y Solter,

un año anterior realizaron la transferencia nuclear con ratones a partir de dos células

cigóticas, esto significa que eran básicamente óvulos fecundados. Mc Grath y Solter

realizaron una técnica donde se producía la enucleación de los pronúcleos del cigoto

mediante una succión con una micropipeta que no atravesaba la membrana plasmática, de

forma que obtenían un carioplasto, que le fusionaban con un cigoto enucleado por medio del

virus Sendai que provoca la fusión de las membranas. Un año más tarde, dichos

investigadores no consiguieron transferir núcleos de blastómeros a cigotos enucleados.

La clonación de mamíferos con células embrionarias no diferenciadas la realizaron

los investigadores Willadsen y el equipo de Neal First en Madison (Wisconsin) unos meses

más tarde. Willadsen (1986) fue el primero en clonar ovejas a partir de células embrionarias

(blastómero de embrión de ocho a dieciséis células) mediante el virus Sendai o electrofusión

con la mitad anucleada obtenida mediante bisección de un ovocito en metafase II. Así se

demostraba que los núcleos de los blastómeros eran totipotentes. Más tarde, en 1987 en el

laboratorio de Neal First (Prather et al) consiguieron transferir el núcleo de un embrión de

vaca a un ovocito enucleado , el cual lo hicieron crecer hasta la etapa de blastocisto para

después transferirlo a una madre subrogada que a los diez meses dio a luz un ternero siendo

el clon en cual habían comenzado.

Posteriormente, en 1994 Sims y First, consiguieron obtener cuatro terneros mediante

la fusión con polietilenglicol de ovocitos enucleados con células cultivadas de la masa

celular interna de blastocistos de 9-10 días. Los embriones que se obtuvieron se mantuvieron siete días en cultivo. Después de este periodo 109 embriones alcanzaron la fase de

blastocisto. De éstos, 34 fueron transferidos al útero de 27 vacas, de las que 13 (49%)

quedaron preñadas. Por último, 4 de éstas dieron a luz terneros.

Campbell y Wilmut19 son los que consiguieron clonar células embrionarias

diferenciadas. La cuestión crucial para estos investigadores era lograr que dichas células

recuperasen el estado que las hiciera capaces de reaccionar como células tempranas.

Entonces Campbell pensó que si privaba a las células embrionarias diferenciadas de

‘alimento’ hasta que estuvieran a punto de morir, éstas podrían alcanzar el estado llamado

gap cero o de quiescencia para ser aptas en la clonación. En agosto de 1995, consiguieron

las primeras ovejas gemelas, llamadas Megan y Morag, clonadas a partir de células adultas

del mismo embrión. Con estos dos animales comenzó verdaderamente la nueva era de la

clonación, es decir una nueva época para la Biotecnología.

Para Wilmut, la idea de clonar una oveja llegó posteriormente como respuesta a

insertar un gen, esto era un proyecto en el que Ian Wilmut estaba interesado. Sin embargo,

el insertar genes dentro de las células embrionarias le resultó tedioso y dificil puesto que

pocos embriones sobrevivieron a dicha inserción, además muy pocos incorporaron el gen

dentro del código genético y un número reducido de organismos desarrolló adecuadamente

el gen en todas sus células. Los trabajos realizados por Willadsen fueron de gran influencia

para las posteriores investigaciones sobre clonación realizadas por Wilmut con células

adultas, es decir adoptaron las técnicas de dicho científico complementándolas con las de

otros científicos y las englobaron en su conjunto. De esta manera en 1990, Wilmut se reunió con Keith Campbell y comenzó a realizar las investigaciones de clonación, abandonando la

idea tradicional de insertar genes e investigar en la posibilidad de clonar mamíferos.

Para la clonación de ovejas por transferencia celular realizada en el Instituto Roslin,

se exigía trabajar con cuatro grupos diferentes de ovejas y unos pocos moruecos (éstos

intervenían en diferentes etapas). Así un grupo de ovejas proporcionaba los ovocitos que

después de ser enucleados, que se convertían en citoplastos receptores. Otro grupo fue el que

facilitó los embriones, cuyas células fueron cultivadas para proporcionar los carioplastos, es

decir los núcleos donantes. Un tercer grupo es el que actuó como receptoras temporales,

incubando dentro de sus oviductos los embriones que eran reconstruidos para llegar a la

etapa de blastocisto. Y por último, el cuarto grupo que funcionó como madres subrogadas,

esto significaba que los blastocistos eran transferidos a sus úteros, donde, al menos algunos,

se desarrollaron dando lugar a crías vivas.

Para realizar tales procedimientos, las ovejas suministraban los carioplastos que eran

de raza diferente a las que donan los citoplastos, de forma que al nacer las crías se pudiera

advertir el linaje, siendo éste claramente visible. En el caso de las ovejas clonadas citadas

(Megan y Morag), las ovejas Welsh Mountain fueron las que donaron los núcleos, mientras

que los citoplastos procedían de las ovejas Scottish Blackface (dichas ovejas también

sirvieron de receptoras temporales y como madres sustitutas). En este sentido, las de raza

Scottish Blackface son más grandes que las Welsh Montain y presentan la cara negra, sin

embargo las de raza Welsh Montain son blancas. El periodo de gestación de tales ovejas

dura unos 147 días, es decir aproximadamente unos cinco meses.

Por otra parte, Campbell dedujo que la realización de la transferencia nuclear debía

hacerse de forma sincronizada (es decir, en la célula embrionaria diferenciada y el óvulo

enucleado) en sus respectivos ciclos celulares. Considerando que las células al duplicarse, siguen un cierto modelo de duplicación en el ADN, pensó que si el ADN de la célula

embrionaria no está en la misma etapa que el óvulo, la técnica de transferencia nuclear no

resultaría satisfactoria. Por ello, Campbell pensó que después de la fecundación, la célula

entra en el ciclo G020 o estado quiescente (es el momento donde se coordinan sus dos juegos de ADN en las respectivas células).


En este sentido, Keith Campbell señaló en el

Memorando 21 para Ian Wilmut que ‘durante la quiescencia se han observado cierto número

de cambios en las células quiescentes. Entre éstos figuran: histonas monofosforiladas

(proteínas que forman la zona central de los cromosomas), centrosomas ciliados (las

estructuras en torno de las cuales se forma el huso en la mitosis), reducción o interrupción

completa toda la síntesis de proteínas, incremento de la proteólisis (degradación de las

proteínas), disminución de la transcripción y aumento de la renovación de ARN que

determina una reducción del ARN total de la célula, desagregación de polirribosomas,

acumulación de ribosomas 80S y condensación de la cromatina’.22 En este contexto, el

estado quiescente significa y representa una etapa relevante para la reprogramación

genómica, es decir es la manera de conseguir que la totipotencia reaparezca en células que

son diferenciadas. Así Megag nació conforme a la técnica de GOAT que significa

‘transferencia del G0 y activación’ (G0 activation and transfer) y la oveja Morag fue

constituida a partir de un citoplasto recipiente universal con el factor promotor de la

maduración bajo. De esta manera, el grupo de investigación que dirigía Ian Wilmut consiguió obtener

por primera vez en mamíferos ovejas normales mediante la transferencia de núcleos de

células de cultivos procedentes de discos embriónicos de blastocistos de nueve días que se

habían mantenido durante 6 a 13 repicados celulares. Antes de realizar la transferencia, las

células del cultivo que fueron sometidas al estado quiescente mediante la reducción de la

concentración de suero 23en el medio de crecimiento. De esta manera, la inducción de la

quiescencia en las células donadoras puede modificar la estructura de su cromatina de forma

que se facilite la reprogramación genética del núcleo. El actual protocolo utilizado por

Wilmut y Campbell se basa al utilizado en el experimento de electrofusión, realizado ya por

Willadsen anteriormente. Una vez sincronizados los ciclos celulares, se procedió a la fusión

de las células diferenciadas de embrión con la célula enucleada mediante un pulso eléctrico.

De esta forma, se lograron obtener las dos ovejas citadas anteriormente, que procedían de

células embrionarias diferenciadas.

El último paso consistía en clonar un mamífero a partir de una célula de un individuo

adulto, esto significaba el poder reprogramar el estado del ADN en las células de individuos

adultos donadoras de los núcleos, para revertir su expresión diferenciada y así poder

restaurar su totipontecialidad.

Hasta que no se produjo el nacimiento de la oveja Dolly, todas las clonaciones que se

habían producido anteriormente eran utilizando células embrionarias o fetales, por ello

Dolly fue el primer clon obtenido a partir de una célula de epitelio de una glándula mamaria

de una oveja de seis años. La clonación de Dolly constituyó una colaboración entre el

Instituto Roslin y Pharmaceutical Proteins Ltd (PPL). Las células adultas se obtuvieron del

PPL puesto que dicha compañía presentaba una línea de células adultas cultivadas de oveja

adulta: las células de glándula mamaria que habían preparado con el Hannah Research

Institute (laboratorio oficial). De esta manera, bajo la dirección del doctor Colin Wilde se

extirparon tejidos mamarios de una oveja Finn-Dorset de seis años que se encontraba en fase

final de gestación. Dicha oveja fue sacrificada. Los tejidos mamarios fueron desintegrados

en fragmentos y los congelaron. El tejido mamario contenía varios tipos diferentes de

células, sin embargo las células que dieron lugar a la oveja Dolly fueron las llamadas células

OME o células epiteliales mamarias ovinas. Por consiguiente, en dicha experiencia, para

que la clonación fuera posible, se utilizaron tres tipos de células cultivadas: unas

provenientes de un embrión de una oveja de nueve días; otras eran células cutáneas

diferenciadas de un feto de oveja de veintiséis días, es decir fibroblastos fetales y cultivos

derivados procedentes de la glándula mamaria de una oveja de seis años en el último

trimestre de gestación.

Intentaron clonar 385 células embrionarias y obtuvieron 126 nuevos embriones, y de 277

células de glándula mamaria obtuvieron 29 embriones. Por último, esos 29 embriones

quedaron seleccionados para su transferencia a las madres sustitutas. Sólo un individuo de

los 277 embriones iniciales con núcleos de glándula mamaria soportó el desarrollo y llegó a

convertirse en una oveja viva (Dolly).

Hay que resaltar que en el experimento de Wilmut y colaboradores (1997), fueron

empleadas también células de fibroblastos fetales que procedían de fetos de Welsh Black de

26 días y que se utilizaron como núcleos donantes. Posteriormente, se prepararon con ellas

172 embriones y se criaron inicialmente algunos en receptoras temporales y otros in vitro.

Se transfirieron 34 de los embriones colocados inicialmente en receptoras temporales a diez

madres sustitutas, de las cuales cuatro quedaron preñadas. Hubo dos que parieron corderos vivos. Estos corderos vivos, habían sido clonados con núcleos de Welsh Black en citoplastos

de Scottish Blackface. Por otra parte, también se transfirieron 6 de los embriones de células

fetales cultivadas in vitro hasta la etapa de blastocisto a 6 ovejas, 1 de las cuáles quedó

preñada y dio a luz un cordero vivo. Sin embargo, murió a los pocos minutos. Este último

hecho demostraba que seguía siendo difícil obtener individuos vivos a partir de blastocistos

de oveja in vitro.

Por otra parte, la apariencia externa de los individuos nacidos correspondía a la raza

de la célula donadora del núcleo y no a la del ovocito enucleado (célula receptora) y de la oveja que había actuado como madre sustituta. Además, hay que señalar que para

comprobar si los individuos nacidos eran obtenidos por clonación, lo que se hizo fue

comparar el ADN microsatélite en cuatro loci polimórficos de los cultivos celulares

donadores de los corderos nacidos y de las madres subrogadas. Así en el caso de Dolly,

PPL y científicos del Roslin realizaron un análisis de microsatélites para asegurarse de que

las células de su cuerpo eran iguales a las de la oveja original. En este sentido, biólogos

moleculares examinaron cinco lugares de microsatélites y estimaron que ‘la probabilidad de

que otra oveja de la misma población tuviera el mismo genotipo de la oveja de seis años’

sería entre 1 de 2000 millones y 1 de 270.000 millones.25

Cabe indicar que en el año 1997, el grupo de Wilmut (Schnieke et al.,1997)

consiguió obtener ovejas transgénicas para el factor IX humano de la coagulación

sanguínea mediante la transferencia nuclear de fibroblastos fetales primarios.26 De esta

manera, la oveja Polly fue clonada. Hasta entonces, los animales transgénicos se obtenían

introduciendo, mediante una microinyección en el óvulo fecundado, una secuencia de ADN

que contenía el gen deseado. Este procedimiento era muy lento y en cierto sentido ineficaz.

Mediante la incorporación de las técnicas de clonación , se dio un paso hacia delante en la

ingeniería genética en animales para producir sustancias tales como proteínas humanas.

También mediante dichas técnicas la supresión génica (eliminación de genes) se convertía

en un hecho, así como la alteración de genes in situ ( es el caso de mutación controlada).

Schnieke y colaboradores, para originar la oveja clonada transgénica llamada Polly,

necesitaron un gen adecuado para la transferencia que poseía un fragmento de ADN que codificaba para el factor IX humano, o sea el gen FIX humano y un promotor de la betalactoglobulina

ovina, es decir, el fragmento de ADN, extraído de una oveja. Dicho

fragmento tiene la función de controlar en la glándula mamaria la expresión de la betalactoglobulina

(proteína de la leche). De esta manera se construyó un transgén que recibió el

nombre de pMIXI. La construcción de dicho transgén se le incorporó un marcador

(fragmento de ADN cuya presencia es fácilmente detectada tras la transferencia). Las

células donantes procedían de fetos de Poll-Dorset de 35 días, es decir eran fibroblastos

fetales de Poll-Dorset, por lo que se denominó PDFF. Posteriormente, introdujeron la

construcción del gen y el marcador adjunto en las células cultivadas mediante la ayuda de

un reactivo llamado Lipofectamina. De esta manera, 10 de los 21 clones transfectados se

transformaron con éxito y demostraron que contenían la construcción pMIX1. Durante cinco

días fueron privadas del factor de crecimiento algunas de las células transformadas

genéticamente para colocarlas en G0. En este sentido, se les redujo el suero de su medio de

cultivo de un 10 a un 0.5%. Finalmente se les restableció el suero al 10% de forma que tales

células continuaron su crecimiento. A continuación, se utilizaron cuatro tipos de células

como donantes nucleares: 2 líneas de células PDFF no transfectadas, una con más de diez

copias del transgén pMIXI y otra con menos de cinco. Se construyeron embriones a partir de

cada uno de los cuatro tipos de células, utilizando ovocitos de ovejas de Scottish Blackface

como citoplastos. Después se prepararon los embriones a partir de las cuatro líneas

celulares que dieron lugar a siete corderos vivos, de los cuales tres de ellos llevaban el gen

introducido. Uno de estos últimos ejemplares expresaba el gen en un nivel bastante elevado

(fue el caso de la oveja Polly). En definitiva, la utilización de células genéticamente

transformadas no parecía aumentar la tasa de mortalidad. El grupo de investigación antes

citado señaló en Science lo siguiente: ‘Un mayor conocimiento de la interacción entre el núcleo transplantado y el citoplasma receptor, y de la relación entre el primitivo embrión y

el entorno materno, así como sistemas de cultivo mejorados, incrementarán el éxito de la

producción y manipulación de embriones in vitro. Más, por el momento, nos vimos

obligados a reconocer que ‘la técnica se encuentra todavía en las primeras etapas y quedan

problemas por abordar’27. Así en los experimentos para obtener a Polly, se utilizaron 104

ovejas (para donantes de ovocitos, para receptoras temporales y madres sustitutas ) y se

produjeron cinco crías transgénicas.

Por otra parte, el grupo de investigación que dirige el Dr Wolf en el Oregon

Regional Primate Research Center obtuvo en 1997, 29 embriones del Macacus rhesus por

transferencia nuclear, a partir de células indiferenciadas (blastómeros de embriones de

pocas células) que fueron implantados en el útero de nueve madres subrogadas, de las que

tres quedaron preñadas y sólo dieron lugar al nacimiento de un macho y una hembra (Meng



et al). No obstante, los más de cien embriones obtenidos en el primer semestre de 1998 por

transferencia de núcleos que procedían de fibroblastos fetales (100) y adultos (9) dieron

resultado negativo (Wolf et al., 1999).

En 1998, las técnicas de clonación quedaron ratificadas, a partir de células adultas de

ratones y bovinos. Así el grupo de investigadores que dirige el Dr Robl obtuvo tres terneros

clónicos a partir de fibroblastos no quiescentes procedentes de un feto de 55 días.

Por otra parte, los estudios anunciados en Nature, el 23 de julio de 1998, por Ryzo

Yanagimachi y Teru Wakayama de la Universidad de Hawai señalaron que habían clonado

un ratón procedente de células adultas, específicamente de células del cúmulo de ovario.

Este experimento resultó muy relevante por dos motivos. Uno de ellos por la utilización de células de adultos que proporcionaban los núcleos celulares y el otro motivo porque se

utilizaron ratones, animales que en cierta medida resultaban difíciles de clonar hasta

entonces. En este experimento el método de clonación (microinyección) utilizado era más

eficiente que el empleado por Wilmut et al.,(electrofusión). No obstante, esta mayor

eficiencia en la clonación de mamíferos procedente del núcleo de células adultas donantes

no supera la eficiencia de un 3% (en el método de microinyección) frente al 1% del método

de electrofusión.

Cabe destacar que ya en el Congreso Internacional de Reproducción Animal de

1998, realizado en Milán, se presentaron también trabajos que describían la obtención de

embriones clónicos de ganado vacuno a partir de células musculares (Shiga et al.,1998) o de

la piel (Takahashi et al, 1998).

Tsunoda y colaboradores (1998) lograron obtener ocho terneras clónicas a partir de

células del cúmulo y de células epiteliales de oviducto de una misma vaca. De las ocho

terneras obtenidas, cuatro murieron nada más nacer.

Posteriormente, en mayo de 1999, Baguisi clonó cabras por transferencia de núcleos

procedentes de células somáticas fetales transgénicas. De esta manera, fueron las primeras

cabras transgénicas que producían leche. En el año 2000, Lanza, Cibelly y colaboradores

(Lanza et al., 2000) obtuvieron seis terneros clónicos a partir de células somáticas

senescentes. También en el mismo año (2000) tres grupos de investigación lograron clonar

satisfactoriamente cerdos (Polejaeva et al. 2000, Betthauser et al.2000, Onishi et al. 2000).

Sin embargo, la clonación no se ha logrado de forma satisfactoria en muchas otras especies

de mamíferos tales como perros, ratas y caballos. Dichas especies son mencionadas aquí

debido a los anuncios públicos que se han ido realizando. Sin embargo, los esfuerzos para

lograr tales clonaciones hayan resultado en vano hasta el momento.

Por otra parte, hay que destacar que en el año 2001, PPL Therapeutics obtuvo cerdos

transgénicos con el gen que codifica para la alfa 1,3 galactosil transferasa inactivado para

evitar el rechazo agudo en xenotransplantes. En febrero del 2002, se clonó un gato que

presentaba la particularidad de que la distribución de las manchas en el pelaje era distinta a

la del individuo original. Dichas manchas eran atribuibles al fenómeno de inactivación del

cromosoma X (Shin et al,.2002) 28. En el mismo año, el Dr Renard y colaboradores en el

INRA francés consiguieron conejos clónicos.

En abril del 2003, un grupo de científicos estadounidenses (Oliver Rider et al.,) del

San Diego Zoo’s Hospital Hill (California) anunciaron el nacimiento de un bóvido asiático

(Bos javanicus) en peligro de extinción conocido con el nombre de ‘bateng’29 que fue

clonado a partir de células de un macho que murió en 1980. Para originar el ‘bateng’

clonado los científicos insertaron ADN procedente de células de tejido epitelial de dicho

bóvido macho que fueron mantenidas en nitrógeno líquido a una temperatura de 196º

grados centígrados bajo cero, hace aproximadamente veinticinco años. Posteriormente, se

realizó la transferencia de núcleos somáticos de estas células de bóvido a óvulos

enucleados de vacas domésticas. El resultado fue la obtención de cuarenta y cinco

embriones que fueron transferidos a los úteros de treinta vacas en el laboratorio de

tecnología embrionaria (Trans Ova Genetics) de Iowa. Por último, dieciséis vacas se

quedaron preñadas y se obtuvieron dos individuos clónicos30 procedentes de estas células

diferenciadas. Estos dos clones nacieron como parte de un proyecto realizado entre la empresa Advanced Cell Technology (ACT), la Sociedad Zoológica de San Diego

(California) y el laboratorio Trans Ova Genetics (Iowa).

Por otro lado, un grupo de científicos de la Universidad de Idaho (EEUU) clonaron

en mayo del 2003 por primera vez un animal estéril, el mulo. Es una especie de 63

cromosomas que resulta del cruce entre un caballo ( 64 cromosomas ) y un burro (62

cromosomas). El mulo, llamado Idaho Gem (‘la Joya de Idaho’) fue el primer equino

clónico obtenido. En este contexto, el director del grupo de investigación en Idaho, Gordon

Woods, considera que es más difícil desarrollar in vitro ovocitos y embriones

reconstruidos de equinos que si se utilizan otros mamíferos debido a que los equinos no

responden de forma adecuada a los tratamientos convencionales químicos utilizados en

clonación. El grupo de investigación mencionado utilizó 305 ovocitos enucleados

procedente de una hembra de caballo. En dichos ovocitos se transfirieron núcleos donantes

procedentes de una línea celular fetal de fibroblastos. En este sentido se utilizaron células

diferenciadas procedentes de fibroblasto fetal de 45 días. Los 113 embriones reconstruidos

fueron transferidos a madres subrogadas. El resultado fue la obtención de un mulo macho

con una apariencia saludable y normal. Woods descubrió que el éxito de la clonación

dependía de un elemento que es el calcio. Dicho investigador y sus colaboradores

observaron que en las células de equinos los niveles intracelulares de calcio son más bajos

que en otras especies. Esta pudo ser la causa de que haya sido difícil clonar a los equinos

anteriormente . De hecho, este grupo de investigación incrementó los niveles de calcio en

los medios de cultivo de estos embriones para obtener un mayor porcentaje de éxito. Según

Woods, los bajos niveles de calcio podrían explicar que la mortalidad de caballos por

metástasis sea más baja que en el ser humano.

Por su parte, en mayo del 2003 se obtuvo el primer caballo clónico. En este sentido,

fue una yegua llamada Prometea que pesó 36 kilogramos. El nacimiento de este animal

clónico tuvo lugar en un laboratorio especializado en técnicas reproductivas, localizado en

Cremona (al norte de Italia, cerca de Milán). En este experimento, la yegua que dio a luz a

Prometea también era su madre genética ( es decir ésta era la donante de la célula

diferenciada adulta de la piel, que se utilizó en la técnica de clonación por transferencia de

núcleo). En este procedimiento, el óvulo en el que se reemplazó el núcleo por material

genético diferente procedía de una yegua no identificada sacrificada en un matadero. Los

investigadores Cesare Galli et al., publicaron este experimento en Nature. Los

investigadores admitieron que Prometea fue el único caballo conseguido a partir de la

técnica de clonación por transferencia de núcleo. Consiguieron mediante esta técnica 513

embriones masculinos y 328 embriones femeninos. De éstos embriones sólo 17 pudieron ser

implantados en yeguas, en las que sólo quedaron cuatro preñadas. Galli afirmó lo siguiente:

‘este acontecimiento es una novedad absoluta y demuestra que es posible el desarrollo de un

feto genéticamente igual a la madre’. Es interesante resaltar que dicho experimento es un

paso hacia delante en lo que se refiere a la obtención de clones de caballos de purasangre.

Al hilo de estas consideraciones, cabe destacar al respecto los resultados obtenidos

por el equipo científico liderado por Jean Paul Renard (jefe del departamento de la Unidad

de Biología del Desarrollo y Reproducción del INRA31 francés) que después de numerosos

intentos sin éxito consiguió, en septiembre del 2003, obtener ratas clónicas.

Este hecho representa un considerable avance en la biomedicina pues facilita la

investigación básica y aplicada de determinadas enfermedades tales como la diabetes, la

hipertensión y diversos trastornos neurológicos.

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