La retinosis pigmentaria en españA: estudio clínico



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IX.4.2.  Gen MKKS

En varias familias de Newfoundland, en donde se había excluído el ligamiento a los cinco loci descritos anteriormente, se realizó una búsqueda genómica de zonas homocigotas candidatas para su estudio (Katsanis y cols., 2000). Una de estas zonas se encontró en el cromosoma 20 en 20p12 en donde se había localizado el gen MKKS. Este gen es responsable del síndrome de McKusick-Kaufman (gen Mkks), que incluye hidrometrocolpos, polidactilia postaxial y cardiopatía congénita (Stone y cols., 2000).

Este gen estructuralmente presenta 6 exones (Figura IX-3) y recientemente se han descrito mutaciones de cambio de sentido (sustitución de un animoácido por otro, se sintetiza una proteína similar) en el gen MKKS, responsables del síndrome McKusick-Kaufman. En este mismo gen se han descrito mutaciones responsables del síndrome de Bardet-Biedl, por lo tanto éste sería el sexto locus y el primer gen caracterizado en este síndrome (Slavotinek y cols., 2000; Katsanis y cols., 2000). Las mutaciones descritas en los casos de SBB son del tipo de pérdida de función del gen lo que significa que el gen no sintetiza proteína. Es posible que polimorfismos en el gen Mkks o variaciones en la región promotora sean los responsables de la variabilidad en el fenotipo. La función específica de la proteína que codifica este gen todavía es desconocida; se trata de una proteína que, por su estructura, se asemeja a una proteína de la familia de las chaperoninas que intervienen en la hidrólisis de ATP.

La existencia de varios loci para este síndrome nos hace pensar en la existencia de múltiples genes involucrados en una misma vía metabólica. Estos genes alterados influirían de manera diferente dependiendo de la mutación y el punto de actuación dentro de la vía metabólica. La identificación de los genes involucrados aportaría la ayuda necesaria para poder comprender los diversos procesos que tienen lugar en esta patología y podría servir de modelo para otras, como la obesidad, hipertensión y diabetes

Debido a la variedad de órganos y sistemas alterados es difícil plantearse qué vía metabólica puede ser la que esté involucrada. Podríamos pensar que distintos genes que actúan en la misma vía pondrían en evidencia diferencias a nivel clínico. El problema con el que nos encontramos a nivel clínico, para determinar diferencias entre los distintos tipos, es el pequeño número de pacientes y la gran variabilidad observada dentro de la misma familia.

CAPÍTULO X
La coroideremia

María José Trujillo Tiebas

Servicio de Genética. Fundación Jiménez Díaz. Madrid.



X.1.  Introducción

La coroideremia (McKusik 303100), también llamada distrofia tapeto-coroidal progresiva, se caracteriza por ser una enfermedad oftalmológica hereditaria ligada al cromosoma X. Fue descrita en 1872 por Mauthner, quien acuñó el nombre debido a la creencia de que los pacientes presentaban una ausencia congénita de la coroides.

La coroides es una membrana vascular que nutre las estructuras del ojo y está situada entre la esclera y la retina en la parte posterior del globo ocular.

Los síntomas de la coroideremia son similares a los de la retinosis pigmentaria. Los pacientes presentan un cuadro de pérdida de visión nocturna, constricción del campo visual, pigmento difuso en el fondo de ojo, electroretinograma abolido con ausencia de respuesta en bastones, membrana de Brüch adelgazada y atrofia coroidal difusa. Estos síntomas aparecen entre la segunda y tercera década de la vida del individuo, pudiendo conservar la función de los conos hasta la sexta década de la vida aproximadamente. Las manifestaciones clínicas se presentan con una gran variabilidad tanto intra como interfamiliar siendo difícil establecer un diagnóstico seguro en pacientes menores de 10 años.

La enfermedad se da en varones debido a su carácter hereditario ligado al cromosoma X. Las hembras portadoras generalmente presentan un fenotipo más suave mostrando áreas con pigmento en el fondo de ojo o algún signo de degeneración del epitelio pigmentario (Mac Donald y cols., 1997).

Se han descrito tres casos de mujeres con síntomas clínicos de la enfermedad. Estos casos son todos ellos debidos a translocaciones del cromosoma X que presentan puntos de rotura en la región donde se encuentra el gen.

La coroideremia se presenta en 1:100.000 individuos nacidos aproximadamente. (Heckenlively y cols.,1988). Como curiosidad cabe destacar que un quinto de los pacientes mundiales referidos en la literatura científica pertenece a una región concreta de Finlandia, la región de Salla. La mayoría de ellos posee la misma mutación y se ha comprobado que es debido a que son los descendientes de una mujer portadora de coroideremia que vivió a mediados del siglo XVII. La enfermedad por tanto se ha transmitido en esta gran familia a lo largo de ocho generaciones hasta el presente (Sankila y cols.,1992).

Actualmente, algunos afectados de coroideremia han sido diagnosticados como afectados de retinosis pigmentaria o de degeneración tapetoretiniana debido a la similitud que presentan con esta patología. Un estudio oftalmológico detallado ayuda a su correcto diagnóstico; los estudios genético-moleculares permiten confirmar este diagnóstico como veremos a continuación (Cremers, 1994a; Ohba, N.,& Isashiki, Y., 2000).



X.2.  Localización y clonaje del gen

La localización del gen de la coroideremia se realizó gracias a los estudios de ligamiento que se centraron en una región concreta del cromosoma X. El gen de la coroideremia se había localizado en la región Xq13-q23 por análisis de ligamiento realizados por distintos grupos entre los años 1985 y 1989 (Lewis y cols.,1985; Nussbaum y cols., 1985; Lesko y cols., 1987; Sankila y cols., 1989). Posteriormente el refinamiento del mapa se realizó debido a la existencia de pacientes con grandes deleciones, detectables con técnicas citogenéticas, que presentaban cuadros sindrómicos en los que la coroideremia aparecía como característica común además del retraso mental y sordera tipo 3 (Rosenberg y cols.,1987; Schwartz y cols., 1988; Cremers y cols., 1989).

Mediante la técnica de Southern Blot se acotó un intervalo del cromosoma X que comprendía las regiones DXS233, DXS165 y DXS95. Posteriormente, mediante técnicas de clonaje posicional los grupos de Cremers y Merry entre los años 1990 y 1992 clonaron una parte del gen CHM (Cremers y cols., 1990; Merry y cols., 1992).

El gen de la coroideremia se aisló finalmente en el año 1994, por van Bokhoven, caracterizándose la región codificante completa y siendo mapeado definitivamente en Xq21.2 (Genome Data Base: X78121; van Bockhoven, 1994a).

El gen de la coroideremia está formado por 15 exones que se extienden a lo largo de 150 Kb. Este gen codifica para una proteína de 653 aminoácidos que constituye el componente A de la enzima llamada geranil-geranil transferasa (GGT). Actualmente se le denomina también «RAB escort protein-1» (Andres y cols.,1993).

Cremers en 1992 identificó un gen humano homólogo de ratón que denominó CHM-L localizándolo en 1q31-qter (Cremers y cols., 1992; 1994b). En 1994 refinó el mapa con una línea de células híbridas de roedor y humano, localizándolo en 1q42-qter. (van Bokhoven y cols., 1994b). Entre el gen CHM y el gen CHM-L se estableció una identidad a nivel nucleotídico de un 80%, y a nivel aminoacídico se estableció una identidad de un 76% con una similitud de un 95% no teniendo en cuenta los cambios conservativos. La expresión de ambos genes ocurría en los mismos tejidos pero a niveles distintos.

La existencia de un gen similar al gen CHM sugería la posibilidad de que el producto de este gen supliese la función del producto del gen CHM en otros tejidos excepto en las células de la retina, donde no se expresaría o lo haría a niveles muy reducidos, dando así una explicación a la enfermedad. Este hecho no supone una novedad en enfermedades oftalmológicas de carácter hereditario.

Los pacientes afectados de atrofia girata, una retinopatía de bastones, presentan una deficiencia de la enzima ornitin amino transferasa. Esta enzima es una proteína ubicua y sin embargo los pacientes que presentan alteraciones moleculares en el gen que la codifica solamente manifiestan síntomas oftalmológicos. Recientemente, se ha comprobado que la expresión de la proteína del gen RP2 implicado en una forma de retinosis pigmentaria ligada al cromosoma X es también ubicua (Chapple y cols., 2000).

Por la proximidad del locus del síndrome de Usher tipo II (síndrome de sordera congénita asociado a retinosis pigmentaria), el cual se encontraba en el mismo segmento, se pensó en el gen CHM-L como gen candidato para esta patología. Se analizó la secuencia del gen en pacientes afectados por esta patología en busca de mutaciones que pudieran relacionarse con ella pero no se encontró ninguna evidencia a favor de esta hipótesis (van Bokhoven y cols., 1994b).

X.3.  Función de la proteína

Las preniltransferasas son enzimas que transfieren grupos poliisoprenos mediante un enlace tioeter a residuos de cisteína de las proteínas de membranas celulares. Los grupos poliisoprenados pueden ser grupos farnesilo de 15 átomos de carbono o grupos geranilo de 20 átomos de carbono, siendo las geranil transferasas (GGT) las que realizarían esta función (Seabra y cols.; 1992; 1993; 1996).

Dentro de las geranil transferasas hay un grupo que tiene por sustrato una larga familia de proteínas de unión al GTP asociadas a membrana denominadas proteínas RAB (Alory, C., y Balch, W. E., 2000).

La geranil geranil transferasa es una enzima compuesta de dos subunidades A y B. Esta enzima tiene la función de transferir grupos isoprenados de 20 carbonos (grupos geranilo) a residuos de cisteínas de proteínas RAB, familia de proteínas de unión a GTP que participan en la regulación del tráfico vesicular dentro de la célula. La función de la geranil geranil transferasa es importante ya que colabora en los procesos de señalización y localización de proteínas en el interior celular. Se sabe que el componente A es el responsable del reconocimiento de los grupos isoprenados y el componente B es el que realiza la transferencia de estos grupos.

La geranil geranil transferasa se expresa en la capa de fotoreceptores y en las células del epitelio pigmentario de la retina y en la coroides, todos ellos tejidos del ojo, pero no es específica de estos tejidos ya que se ha visto también expresada en otros tipos celulares como en linfocitos o fibroblastos.

Las proteínas RAB se unen a membranas de orgánulos específicos en el interior celular. Se cree que regulan la identificación y la fusión de membranas de vesículas durante el ensamblaje y transporte de orgánulos, es decir regulan los eventos de fusión que subyacen a la endocitosis y exocitosis de orgánulos celulares. Las proteínas RAB, también regulan el intercambio de GTP a GDP, mediante hidrólisis del enlace GTP, regulando de esta forma la unidireccionalidad y coordinando estos procesos. Las proteínas RAB se encuentran de forma inactiva en su forma de unión al GDP y de forma activa en su forma unida al GTP (Alory, C., y Balch, W. E., 2000).

Todas las proteínas RAB tienen en su extremo carboxi-terminal los siguientes motivos CysXCys ó CysCys, por el que son reconocidas por las geranil transferasas. Se cree que estas cisteínas son geraniladas por estas enzimas aunque el lugar de unión a las proteínas RAB ocurre en motivos más alejados de estas secuencias. La unión de estos grupos geranilo ocurre poco tiempo después de la traducción de la proteína.

Dentro del grupo de proteínas RAB que por ahora se conocen destacan las siguientes: la proteína RAB 3A que se une a vesículas sinápticas de neuronas y la proteína RAB 1A que se localiza en el retículo endoplasmático.

El componente A de la GGT de 95 Kd reconoce las secuencias conservadas en las proteínas RAB. El componente B posee la actividad catalítica, transfiere los grupos geranilo y se inactiva en ausencia del componente A. Está constituido por un dímero de dos subunidades a y b cuyos pesos moleculares son de 60 y 38 Kd respectivamente.

Existe una familia de componentes A de estas enzimas específicos de distintas proteínas RAB una de los cuales sería la que se relaciona con coroideremia. El componente A implicado en coroideremia parece presentar mayor afinidad por la proteína RAB 3A que por la RAB 1A.

En 1993 Seabra, renombra al componente A implicado en la coroideremia como «RAB-Escort Protein» (REP-1), es decir proteína de escolta de las proteínas RAB, ya que parece que su misión no se limita al reconocimiento de estas regiones sino que las presentan al componente B, escoltándolas durante la reacción de transferencia y probablemente después también, hacia su lugar de destino.

La función del componente A se resume de esta forma:

1.  Reconocimiento de la proteína RAB.

2.  Presentación de los sitios a geranilar al componente B, acelerando así el proceso catalítico.

3.  Disociación del complejo RAB+componente A del componente B.

4.  Presentación de la proteína RAB a su lugar de destino.

En resumen, parece ser que las modificaciones en proteínas solubles con grupos prenilos, permite el anclaje de éstas en la membrana de vesículas donde se dan importantes procesos de regulación como señales de modificación post-traduccional, movimiento del citoesqueleto, tráfico de proteínas en el interior celular. La pérdida de la proteína de escolta de las proteínas RAB, provocarían un defecto en la prenilación de estas últimas, provocando un compromiso entre las vías de exocitosis y endocitosis intracelular provocando a larga, una muerte celular. Se ha observado que la proteína RAB-27 puede prenilarse a niveles más bajos, gracias a la actividad de CHM-L. Esto podría explicar el carácter progresivo de la enfermedad.

Los defectos en los procesos de regulación del tráfico vesicular provocarían una reducción en las capacidades de la célula a resistir el «stress» exógeno provocado por diversos factores, tales como la fluctuación del tránsito de metabolitos, infecciones, radiación o la muerte de células próximas. La variabilidad en la expresión clínica de la enfermedad podría explicarse debido a diversos factores genéticos.



X.4.  Estudio de mutaciones

Se ha observado que las alteraciones genéticas que se encuentran en este gen son similares en todas las poblaciones en las que se ha descrito (Schwartz y cols., 1993; van Bokhoven y cols., 1994c; Nesslinger y cols., 1996; van der Hurk y cols., 1997a; Preising M., 1998; Fujiki K y cols., 1999). En España se han encontrando resultados muy similares (Trujillo y cols., 1998).

En la mayoría de los pacientes, las alteraciones moleculares que se conocen son en su mayoría pequeñas deleciones, inserciones o mutaciones que provocan un codón de parada prematura, es decir mutaciones que truncan la proteína haciéndola claramente no funcional.

Las mutaciones puntuales o pequeñas inserciones-deleciones se han detectado del exón cinco al catorce. Parece ser que las mutaciones alojadas en el exón quince no provocan coroideremia ya que se ha comprobado que la ausencia de los últimos cuarenta y nueve aminoácidos del extremo C-terminal no impide a la proteína realizar su función (van den Hurk et al., 1997a). Se desconoce por qué no se han detectado mutaciones de este tipo en los exones del uno al cuatro.

Como se podrá apreciar las mutaciones que se describen a continuación inactivan de forma total el producto del gen CHM/REP-1. Un 70% de las mutaciones provocan un codón de parada prematura por el propio cambio o como consecuencia de éste.

Mutaciones que provocan un codón de parada prematura

Suelen ser mutaciones de cambio de nucleótido. También se ha descrito una pequeña deleción de dos bases y una inserción de una base que ocurre al mismo tiempo.

En España se ha encontrado una mutación en el exón ocho del gen de la coroideremia; esta mutación corresponde a una transversión C  A, que sustituye el aminoácido serina en el codón 340 por un codón de parada. Se estudiaron a diez miembros de la familia, de los cuales, tres varones presentaban la mutación y dos hembras eran portadoras. (Trujillo y cols., 1998).

Mutaciones que provocan un cambio en el marco de lectura

La mayoría son pequeñas deleciones y el resto son pequeñas inserciones.



Mutaciones que provocan un cambio en el lugar de corte-empalme

Debidas a mutaciones puntuales y a pequeñas inserciones en el gen.



Mutaciones de cambio de aminoácido

En una ocasión se describió una mutación de cambio de aminoácido donde no se tenía muy clara su verdadera implicación en la enfermedad. Se especuló que podría estar en un sitio clave para el correcto funcionamiento de la proteína, ya que el cambio que generaba no era conservativo (cambio de un aminoácido ácido por otro neutro), (Donelly y cols.;1994). Otras explicaciones que se postulaban eran que la aparición de la coroideremia en ese paciente podría no ser debido al cambio de aminoácido sino a que la mutación provocara un RNA inestable o un sitio de corte-empalme críptico; incluso podría deberse a una segunda mutación en el gen más drástica, aún no detectada. Tres años más tarde se pudo comprobar tras un análisis por RT-PCR, que la mutación localizada en el penúltimo nucleótido del exón once, provocaba una alteración en el procesamiento de corte-empalme del RNA mensajero, como consecuencia el exón once no se transcribía y se generaba un codón de parada en el exón doce (Beaufrere y cols., 1999).

La ausencia de mutaciones que provocan cambio de aminoácido parece indicar que, si existen éstas, no se acompañan de síntomas clínicos, sin embargo si esto fuera cierto, implicaría la existencia de una baja presión selectiva en la conservación de la secuencia, cosa que contradice la elevada homología que parece presentar este gen con el homólogo de rata o de ratón. La escasa frecuencia de polimorfismos descritos en la secuencia del gen parece apoyar la idea de que en realidad corresponde a una secuencia muy conservada. Una explicación más plausible sería que las mutaciones de cambio de aminoácido provoquen en realidad otra situación patológica en tejidos distintos de la retina.

Polimorfismos

En este gen se ha caracterizado un polimorfismo localizado en el primer fragmento del exón cinco que corresponde a un cambio de adenina por guanina, Esta transición no provoca el cambio de aminoácido (alanina) en el codón correspondiente (117). Este polimorfismo se presenta con frecuencias alélicas muy similares comparando la población canadiense en la que se describió y la población española (Nesslinger y cols., 1996).



Grandes deleciones

En el análisis de las mutaciones del gen responsable de la coroideremia se ha puesto de manifiesto que, aproximadamente un 25% de los pacientes europeos, presentan deleciones cromosómicas grandes. Los estudios realizados en pacientes alemanes parecen confirmar que este fenómeno es bastante frecuente en esta enfermedad (Preising M., 1998; Tesis Doctoral).



Translocaciones

Se han descrito tres casos en la literatura científica de mujeres que, entre otros síntomas clínicos, presentan coroideremia (Kaplan y cols.;1989; Siu y cols.;1990; Lorda-Sánchez y cols., 2000). En los dos primeros casos la causa de la enfermedad era debida a la interrupción del gen de la coroideremia debido a una translocación X-autosoma, en concreto (X;13)(q21.2;p12) y (X;7)(q21.2;p12) donde los puntos de rotura se encontraban en el intrón doce y en el exón tres o en el exón cuatro respectivamente.

En este tipo de translocaciones se sabe que la inactivación del cromosoma X no ocurre al azar, dándose una inactivación preferente del cromosoma X no translocado. De esta forma se asegura que el fragmento de autosoma translocado al otro cromosoma X permanezca activo. Este mecanismo evita la falta de expresión de los genes autosómicos; la inactivación de estos últimos siempre acarrearía consecuencias biológicas más perniciosas que el hecho de perder los genes directamente involucrados en las regiones cromosómicas donde se produce la translocación. No obstante, parece que el gen CHM/REP-1 escapa parcialmente a la inactivación, por lo que se especula que la presencia de niveles bajos de REP-1 funcional podría explicar la levedad relativa que manifiestan estas mujeres (Mac Donald y cols.;1997; Carrel & Willard., 1999; Carrel y cols., 1999).

En España existe otra paciente femenina diagnosticada de coroideremia entre otros síntomas debiendo su enfermedad a una translocación 4;X cuyos puntos de rotura son (X;4)(q21.2;p16.3). La translocación pudo haber provocado una pérdida del gen CHM o una interrupción en su secuencia. En esta paciente además se descartó la existencia de mutaciones en el gen de la b-fosfodiesterasa. Este gen está localizado en el cromosoma 4p.16 y se ha visto involucrado en retinosis pigmentaria autosómica recesiva.

Hay que destacar que las mujeres con este tipo de traslocaciones presentan también disgenesia gonadal. Este fenómeno es consecuencia de la propia translocación X-autosoma debido a que comprende la región proximal a Xq (Lorda-Sánchez y cols., 2000).

En la actualidad se considera que el diagnósico clínico de la coroideremia puede ser realizado con un sencillo análisis de inmunoblot con anticuerpos anti-REP1. Esto mostraría la ausencia de la proteína CHM/REP1 en muestras se sangre periférica. Como la mayoría de las mutaciones crean un codón de parada o truncan la proteína, la mayoría de los pacientes podrían ser diagnosticados por este procedimiento (MacDonald y cols., 1998).

En aproximadamente un tercio de los pacientes europeos no se han podido identificar las mutaciones responsables de la patología. Esto podría tener explicación si se demostrara la heterogeneidad genética en esta enfermedad.

En líneas generales se ha observado que la retina presenta un escaso repertorio patológico lo que hace que se manifiesten de forma similar patologías cuyo origen genético es distinto, la extremada heterogeneidad genética y alélica que muestran en general todas las enfermedades oftalmológicas hereditarias junto con la ausencia de ligamiento a este gen con marcadores intragénicos de algunas familias españolas nos hacen plantear de forma abierta esta posibilidad. El análisis de ligamiento en grandes familias permitirá confirmar esta hipótesis. No obstante, la presencia de dos polimorfismos de tipo microsatélite, uno en el intrón nueve y otro del intrón catorce, junto con el polimorfismo nucleotídico en el exón cinco y tres polimorfismos para tres dianas de restricción en el intrón ocho, pueden ayudar a aclarar la situación en aquellas familias que soliciten


un consejo genético (van Bokhoven y cols., 1994d; van Bokhoven
y cols., 1996; Nesslinger y cols.,1996; Molloy y cols.,1992).

Es evidente que los estudios genéticos están ayudando a clasificar correctamente a aquellas familias que presentan enfermedades ligadas al cromosoma X al arrojar luz sobre la compleja heterogeneidad genética que manifiestan.



X.5.  Modelos animales

Entre los genes de CHM de ratón y humano existe un 88% de identidad nucleotídica y un 97% de similitud entre las proteínas si no se tienen en cuenta los cambios de aminoácidos conservativos. Este hecho demuestra un alto grado de conservación evolutiva.

En 1997 se utilizaron ratones quiméricos portadores del gen CHM/REP-1 con alguna interrupción en su secuencia con el fin de establecer un modelo animal de la coroideremia (van den Hurk y cols., 1997b). Los ratones quiméricos varones tuvieron todos ellos hijas portadoras, las cuales no transmitieron el gen alterado a ninguno de sus descendientes, ni a varones ni a hembras. La explicación que dieron los investigadores a este curioso fenómeno fue que en embriones de roedores la presencia de cualquier mutación en este gen debería ser letal y esto haría inviable a los embriones varones.

Se sabe que en las hembras de roedores se da una inactivación preferente del cromosoma paterno en tejidos extraembrionarios. En estos tejidos la expresión del gen CHM/REP-1 parece que debe ser esencial. Las hembras portadoras de esta tercera generación presentarían por tanto como cromosoma activo aquel que porta la mutación, lo que provocaría que las hembras fueran también inviables.

Los resultados obtenidos con los modelos animales nos hacen reflexionar sobre la función del gen CHM. Las mutaciones de cambio de aminoácido ¿podrían en humanos ser letales en estadios embrionarios tempranos al modificar de alguna forma la función de la proteína?, ¿podrían estar relacionadas con otras patologías? y, en caso afirmativo, ¿estamos de nuevo ante una enfermedad oftalmológica con elevada heterogeneidad alélica y/o genética?; ¿existen otros factores epigenéticos o ambientales que modulan la expresión clínica de esta enfermedad?

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