La retinosis pigmentaria en españA: estudio clínico



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XII.1.1.  El futuro del diagnóstico molecular

La caracterización de mutaciones en genes ya implicados en RP, y por ende el diagnóstico etiológico basado en análisis de ADN, es en la actualidad una tarea de alto coste y muy laboriosa. Aunque la introducción de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a mediados de los años ochenta (Saiki y cols., 1985), cambia radicalmente el análisis molecular, las técnicas actuales basadas en la PCR son insuficientes para efectuar un análisis sistemático de los genes implicados en la RP. Estos genes (Rodopsina, RDS, ROM1, PDEA, PEDB, CGNN1, RPGR, RPE65...), son rastreados, en la actualidad, por múltiples grupos de investigación a la búsqueda de mutaciones relaccionadas con la enfermedad mediante técnicas de detección de mutaciones basadas en la PCR tales como el SSCP (Orita y cols., 1989), DGGE (Myers y cols., 1987) y EMD (del Tito y cols., 1998); que por otro lado, tienen una sensibilidad discutible y, en general, poco estudiada (Ruiz y cols., 1997).

Junto a estas metodologías para el rastreo de los genes implicados, algunos grupos de investigación han desarrollado métodos indirectos mediante el empleo de microsatélites intragénicos o ligados a los genes candidatos que permiten efectuar análisis de segregación de un locus determinado en las distintas familias afectas de RP, previo al análisis directo del gen mediante SSCP,DGGE o EMD (Bayes y cols., 1996; Marcos y cols., 2000, Marcos y cols. en prensa). El problema de esta estrategia, es que tan sólo es aplicable en familias informativas y, por tanto, es una solución limitada en el abordaje de genes implicados en la RP. No obstante, su utilidad se incrementa en la identificación de nuevos genes relacionados con RP, siempre que se realice una buena selección de familias.

Para solventar el problema de la fiabilidad, coste y rapidez del análisis de los genes implicados en la RP será necesario la aplicación de las nuevas tecnologías actualmente emergentes en el campo del diagnóstico molecular. Específicamente, la implementación de la tecnología de microchips de ADN gen-especificos (Hacia y cols., 1996), junto a la estandarización de las técnicas de PCR de fragmentos largos, (Barnes, 1994) podrían ser de gran utilidad para la comunidad científica y prometen completar el análisis de estos genes en los pacientes con RP en escasos días en un futuro no muy lejano. Este análisis incluirá tanto intrones como exones, localizando en un solo paso las mutaciones y polimorfismos que se presentan en diversos genes. El desarrollo de otras herramientas biotecnológicas, hoy incipientes, como la secuenciación bidireccional a gran escala, la bio-nano-manipulación, el rastreo molecular dinámico (DMC), la genotipación espectral y la espectrometría de masas o las nuevas técnicas de microscopía, prometen una mejora, a medio plazo, de las técnicas de rastreo del genoma y la búsqueda de mutaciones (Fischer y Klose, 1995). Estas y otras tecnologías permitirán reducir notablemente el tiempo de diagnóstico y la catalogación de los pacientes con mutaciones en genes conocidos, así como un rápido rastreo de múltiples genes candidatos. El caudal de información que generará el análisis completo de mutaciones y polimorfismos de múltiples funciones génicas relacionadas con la RP revolucionará la concepción que actualmente se tiene de la correlación fenotipo/genotipo y la información sobre el pronóstico de la RP. En este sentido, se podrán identificar los factores que modulan las distintas mutaciones relacionadas con la RP, así como sus patrones clínicos de una forma más precisa e inteligible. (Lisman y Fain, 1995).



XII.1.2.  La identificación de nuevos genes relacionados
con la RP

Se postula que la mayoría de los genes relacionados específicamente con la fisiología de la retina podrían estar mutados en algunos de los déficits visuales hereditarios (Dryja, 1990). Esta concepción abre un amplio abanico de posibilidades en cuanto al abordaje molecular de las bases genéticas de la RP.

El desarrollo de las diferentes estrategias de identificación de nuevos genes de RP ha estado estrechamente relacionado con los progresos del proyecto genoma humano en dos de sus materias fundamentales: I) La identificación de nuevos genes, ya sea mediante análisis de ligamiento y posterior mapeo físico de regiones cromosómicas, o mediante la localización y aislamiento de funciones fisiológicas en diferentes modelos de estudio y la posterior identificación y localización de los genes ortólogos homólogos en humanos (clonaje posicional y funcional). II) El progresivo desarrollo de los mapas genéticos basados en secuencias polimórficas en tándem (VNTR y STR) han dotado a los genetistas de una batería de polimorfismos impensable hace tan sólo diez años (Dib y cols., 1996).

Ambas fuentes de información han generado dos estrategias paralelas para la identificación de genes relacionados con la retinosis pigmentaria y otras enfermedades genéticas. La primera, tal vez la más efectiva en el campo de la RP, es el análisis directo de genes candidatos, que defiende la formulación y comprobación de una hipótesis de relación entre una proteína y una determinada patología merced a la función desarrollada por la proteína y su hipotética vinculación con la patogenia y clínica de la enfermedad (Dryja y Berson, 1995). Buena parte de los genes RP han sido identificados mediante esta estrategia (Rodopsina, RDS, ROM1, PDEB, PDEA, CGNN, MERTK...) La desventaja de esta metodología es que reduce el campo de trabajo a los conocimientos de la fisiología del tejido diana y la etiopatogenia de la enfermedad, en la actualidad muy incompleta.

La otra estrategia (clonaje posicional), parte del estudio de ligamiento mediante marcadores genéticos polimórficos de familias afectas de RP para la identificación, inicialmente, de regiones cromosómicas donde se ubican los genes responsables de la enfermedad. A partir de aquí, dos son los caminos a seguir, por un lado el análisis de genes candidatos por posición: rastreo de aquellas funciones localizadas dentro de la región ligada, que pudieran relacionarse con la enfermedad en cuestión. En el caso de no existir genes candidatos se procede al mapeo físico de la región y al análisis sistemático de los genes contenidos en la misma (una tarea sin duda formidable con la tecnología actual, puesto que en un intervalo de 2-4cM del mapa genético suelen concurrir entre 60-120 genes que deben ser reconocidos, aislados y rastreados en busca de mutaciones).

La extraordinaria heterogeneidad de la RP ha llevado al estancamiento de muchos de los proyectos de clonaje posicional. De hecho, mediante esta estrategia tan sólo se ha identificado siete genes RP hasta la fecha, todos ellos en los últimos cinco años merced a las nuevas herramientas de mapeo físico o al abordaje directo de genes candidatos por posición (Meindl y cols., 1996; Gu y cols., 1997; Maw y cols., 1997; Martínez-Mir y cols., 1998; Hagstrom y cols., 1998; Schwahn y cols., 1998; Pierce y cols., 1999; Sullivan y cols., 1999). El resto de los locus permanecen como localizaciones anónimas dentro del genoma y los genes subyacentes continúan sin conocerse. Sin embargo, su conocimiento permitirá identificar nuevas funciones o vías metabólicas que están relacionadas con la etiología de la RP, a diferencia de lo que ocurre cuando analizamos genes candidatos (Dryja y Berson, 1995).

En este escenario es fácil comprender cómo los avances en el proyecto genoma humano favorecen y favorecerán en un futuro el desarrollo de las estrategias anteriormente propuestas. Así, por ejemplo, la densidad creciente de mapa genético disponible ha pemitido implementar estrategias de ligamiento como el mapeo de homocigosis (Lander y Botstein, 1987), que hace pocos años eran pura teoría, con unos resultados espectaculares en cuanto al número de nuevos locus identificados desde su aplicación a partir de la primera generación de los marcadores de provistos por Généthon (Farral, 1993). Además se están diseñando estrategias analíticas (Reis y cols., 1996) y matemáticas (Kruglyak y cols., 1995) para estandarizar las búsqueda sistemática a lo largo del genoma (genome wide scanning) y de esta manera desarrollar herramientas genéticas para el análisis de enfermedades de herencia compleja, multifactorial o poligénica (Kruglyak y Lander, 1995).

Sin esperar a que estos conceptos arraigen en la comunidad científica, una nueva generación de marcadores (marcadores parsimoniosos) se está introduciendo ya en el campo de la genética molecular. El desarrollo de este nuevo mapa genético, basado en marcadores dialélicos (SLP: single lenght polymorphism), promete modificar radicalmente las estrategias de ligamiento y clonaje posicional para mejorar la eficiencia del mapeo y la identificación de nuevos genes relacionados con las enfermedades genéticas (Brown y Hartwell, 1998). Aunque el rápido desarrollo de las técnicas de ligamiento que no necesitan la genotipación de marcadores polimórficos (GMS: genome mismatch scanning) podrían dejar obsoletos estos mapas incluso antes de que aparezcan (Nelson y cols., 1993; Kruglyak y McAllister, 1998).

Otra iniciativa emergente y muy prometedora dentro del proyecto genoma es la localización sistemática de genes o fragmentos de secuencias expresadas (ESTs), mediante el empleo paneles de células híbridas ratón/humana, dentro del denso mapa genético disponible. Este esfuerzo ha supuesto la aparición de una nueva y revolucionaria herramienta para el rastreo de genes relacionados con la RP y otras enfermedades: el mapa de transcripción humano (Schuler y cols., 1996), del que ya aparecen prometedoras aplicaciones en el campo de la genética médica (Ruiz y cols., 1998) así como interesantes propuestas encaminadas a mejorar la eficiencia de los estudios de ligamiento basadas en la densidad de genes a lo largo del genoma (Inglehearn, 1997).

Una vez que el mapa de transcripción esté completado, se conocerán todos los genes existentes en la dotación genómica humana, su precisa localización y la expresión de los mismos en diferentes librerías de ADNc tejido-específicas. Esto ayudará a localizar con precisión los productos génicos menos ubicuos (tejido-específico) que serán una fuente interesante de funciones candidatas. Sin embargo, después de culminar este mapa, quedará la tarea más complicada y a su vez estimulante del proyecto genoma humano para los científicos del próximo siglo: la de comprender e interrelacionar las diversas funciones de estos genes así como la de buscar sus relaciones con las distintas enfermedades que padece nuestra especie, objetivo prioritario del Proyecto Genoma Humano (Strachan y Read, 1996).



XII.2.  Patogenia de la RP

En la actualidad se desconoce el mecanismo por el cual una mutación de un gen expresado exclusivamente en los bastones o EPR conduce a la desorganización completa de las capas de conos y bastones, nuclear externa y plexiforme externa de la retina así como a la semiología propia de la RP (Papermaster y Windle, 1995). Sin embargo, gracias al estudio sobre modelos animales clásicos de degeneración retiniana (rd, rds, rcs) o ratones knock out y transgénicos ya existen algunos datos e hipótesis interesantes de lo que puede estar ocurriendo en la retina de los pacientes con RP.

Durante la década de los noventa, varios estudios han apuntado hacia la apoptosis (muerte celular programada, PCD) como la vía final de degeneración en los distintos modelos de RP estudiados (Chang y cols., 1993; Papermaster y Nirl; Portera-Cailliau y cols.;Lolley y cols.; Tso y cols., 1994). Aunque es prematuro efectuar una generalización, esta aseveración implica que, en la patogénesis de la RP, podría ocurrir una activación anómala del programa de autodestrucción celular existente o latente en todas las células. La apoptosis aparece típicamente en las células del SNC (Sistema nervioso central) durante el desarrollo (Young, 1984; Penfold y Provis, 1986), pero, al completarse la ontogenia, se silencia por completo en la retina adulta y sana. El enlace entre la tremenda heterogeneidad etiológica que se demuestra en la RP y los mecanismos generales de apoptosis es, sin duda, uno de los puntos más oscuros de la patogenia de la RP. En cualquier caso, este es un campo de actualidad, no sólo en RP, debido a la implicación de genes apoptóticos y anti-apoptóticos con la aparición del cáncer, el desarrollo del SNC y los procesos neurodegenerativos (Hengartner y Horvitz, 1994). Habrá que esperar pues en el futuro inmediato importantes avances en esta área que arrojarán nueva luz sobre su relación o no con la etiopatogenia de la degeneración retiniana.

Por su parte, los estudios de modelos animales han conducido al establecimiento de diversas hipótesis sobre el estado patológico a nivel del fotorreceptor. Así, estudios sobre el modelo rd de ratón parecen demostrar que la alteración de la homeostasis de los niveles de GMPc intracelulares en el bastón, antecede al proceso degenerativo (Lolley y cols., 1977). En el caso concreto del ratón rd la inactividad de la fosfodiesterasa sería la causa de la elevación de los niveles de GMPc(Bowes y cols.,1990). En el caso del modelo knock out de rodopsina, sería la inactivación completa de la cascada (Humphries y cols., 1997). En el caso de la rata RCS(Royal College of Surgeons) es la inactividad del receptor de la tirosin quinasa Mertk y fallo de la fagocitosis del segmento externo del fotorreceptor (D’cruz y cols., 2000). Sin embargo, se especula sobre la posibilidad de que otros factores puedan elevar la concentración de GMPc intracelular mediante la activación o inactivación de otras cascadas bioquímicas alternativas, concomitantes o complementarias a la cascada de fototransducción.

Por otra parte, el modelo de degeneración retiniana mediada por luz demostrado en ratones y las mutaciones identificadas en el gen CGNN asociadas a la RP apoyan que las células de la retina de los pacientes RP, por mutaciones en distintos genes, pueden reproducir una situación equivalente a la exposición continua a la luz brillante (hipótesis del equivalente de luz, Fain y Lisman, 1993). Este mecanismo patogenético es muy discutido por diferentes autores (Sieving y cols.;Li y cols., 1995) pero los recientes trabajos sobre la prevención de la degeneración retiniana mediada por luz, en ratones knock-out del gen c-fos, parecen enlazar esta hipótesis con la apoptosis o con un mecanismo de degeneración de los fotorreceptores que pudiera ser común en alguno de sus procesos, (Hafezi y cols., 1997). Aunque los resultados no aclaran el porqué de esta situación, el experimento plantea, por primera vez, la posibilidad de intervención sobre los factores que parecen mediar en la degeneración retiniana (Steele, 1997). Este trabajo pone de manifiesto la importancia del fondo genético sobre el que aparecen las mutaciones, que moldea sobremanera el cuadro clínico final. Además, abre una nueva vía de investigación de la prevención de la ceguera en las degeneraciones retinianas a través del bloqueo farmacológico del proceso de degeneración de los fotorreceptores. Por otra parte, recientemente, estudios realizados en ratones deficientes del gen rpe65, involucrado en la regeneración de rodopsina, parecen indicar que la rodopsina es esencial para la generación de las señales de muerte intracelular mediadas por la luz (Grimm y cols., 2000).

Todos estos argumentos indican la importancia del desarrollo y meticuloso estudio de los modelos animales de degeneración retiniana. Las técnicas de ingeniería genética para la construcción de ratones knock-out o transgénicos dotan al investigador de una herramienta de primer orden para dilucidar la patogenia de las diversas formas de RP y son la base más apropiada para la elaboración de ensayos terapéuticos preclínicos de cualquier índole. Es por ello sencillo apostillar que, en base a la aplicación de estas tecnologías al campo de la RP, aparecerán nuevos datos relacionados con la compleja etiopatogenia de la RP en un futuro no muy lejano.



XII.3.  Expectativas en el tratamiento de la RP

En la actualidad, la RP es una enfermedad sin tratamiento que conduce progresivamente a la pérdida visual de los individuos que la padecen. Las diversas disciplinas enfocan el problema de la terapéutica de la RP desde muy diversos prismas. Esta lógica disparidad de criterios en ocasiones se ha interpretado, por el colectivo de afectados, como un problema de conflicto de intereses entre los diversos profesionales involucrados en el estudio del problema o manejo de los pacientes. La realidad es que ninguna de las alternativas terapéuticas que se barajan para un futuro, debe considerarse como definitiva o excluyente del resto, sino complementaria de las demás y aplicable según el estadio y subtipo de la enfermedad que afecte al paciente.

— Terapia génica y transplante de retina: ¿las grandes esperanzas?

Sin duda, las expectativas generadas por los avances en el desarrollo de las estrategias de terapia génica y transplante de fotorreceptores o epitelio pigmentario (EPR) en el colectivo de pacientes hacen a estas dos iniciativas terapéuticas como las más conocidas. Actualmente, las vías mejores de acceso a las células diana (Mashhour y cols., 1994), el estudio de los vectores más adecuados para transfectar in vivo al ojo (Ali y cols., 1996, Takahashi y cols., 1999, Galileo y cols., 1999), el rescate in vivo o transgénico de diversos modelos animales (Lem y cols., 1992; Bennett y cols., 1996, Jomary y cols., 1997, McNally y clos., 1999) y el transplante de EPR o fotorreceptores fetales son temas de rigurosa actualidad en el campo de la retinosis pigmentaria (Gouras y cols., 1994, Sheng y cols., 1995, Sauve y cols., 1998, Little y cols., 1998, Luthert y cols., 1998).

En base a los primeros resultados, el futuro de la terapia génica parece prometedor a medio plazo. En cualquier caso, su aplicación sistemática indudablemente requiere un avance sustancial en las múltiples disciplinas que interaccionan en estos programas de tratamiento: virología, inmunología, genética molecular, bioquímica y fisiología retiniana, microcirugía oftalmológica, etc.

Tal vez el dato más desalentador sea la tasa de pacientes portadores de RP que en la actualidad podrían entrar en programas de terapia génica. Puesto que si nos atenemos a los criterios del comité de vigilancia de protocolos de terapia génica (RAC, ver tabla XII-1) sólo se pueden tratar aquellas patologías hereditarias en las que se conoce con certeza su base genética; es decir aquellos casos de RP en el que las mutaciones estén caracterizadas y perfectamente relacionadas con la patología en estudio; de nuevo el problema de la heterogeneidad genética paraliza las expectativas de tratamiento a gran escala.


Tabla XII-1. Requerimientos mínimos para una terapia de transferencia génica en un trastorno genético.
— Identificación del locus afectado

— Impacto sustancial de la enfermedad y proporción riesgo beneficio favorable en comparación con terapias alternativas

— Conocimiento suficiente de la base bioquímica de la enfermedad para asegurarse que la transferencia génica corrija la patología bioquímica y prevenga o invierta las anomalías fenotípicas fundamentales

— Una célula diana apropiada con biología suficientemente definida y, de manera ideal, una vida media larga o buen potencial de replicación in vivo

— Datos adecuados de cultivos celulares y de estudios en animales que sugieran que el vector, la construcción del gen y la célula diana son apropiados

Recombinant DNA Advisory Comitee of the NIH.
Por su parte, los avances en neurobiología y microcirugía oftalmológica, han cosechados importantes avances en el campo de la transferencia de células, bien epitelio pigmentario, bien fotorreceptores, a la retina enferma de RP con resultados realmente interesantes (Gouras y cols., 1994; Sheng y cols., 1995). La controversia de estas técnicas tal vez aparezca debido a la necesidad de trabajar con tejidos vivos (usualmente fetales), así como el momento de la indicación de los transplantes. No obstante el cultivo de células nerviosas multipotentes y el estudio de los factores que controlan su diferenciación pueden dar sus frutos los próximos años para dar un vuelco a las expectativas de reconstrucción del tejido nervioso enfermo a partir de células nerviosas transplantadas o reactivadas (McKay, 1997).

— La terapia farmacológica del siglo XXI



Las iniciativas terapéuticas anteriormente expuestas son deslumbrantes y de gran interés científico, pero no por ello se han de considerar como únicas vías de resolución del problema de la RP. No son pocas las voces que se elevan insistiendo en que el desenmascaramiento del mecanismo patogénico de la RP conducirá, probablemente, a estrategias de tratamiento farmacológico efectivas (Meintiger, 1997).

En este sentido existen, en nuestra opinión, dos líneas de investigación cuyos resultados preliminares parecen muy prometedores: I) Se sabe que el crecimiento y supervivencia de muchas poblaciones neuronales depende de señales proveídas por sus células diana (Levi-Montalcini, 1987). La importancia del estudio de los factores que controlan la diferenciación, polaridad y tropismo neuronal en las retinopatías degenerativas, se ha puesto de manifiesto con estudios de rescate de la degeneración retiniana, mediada por luz, con el tratamiento mediante diversos factores neurotróficos (LaVail y cols., 1992, Ogilvie y cols., 2000). II) Otra línea emergente es el diseño de fármacos anti-apoptosis para controlar el procesos de muerte celular programada (Holtzman y Deshmukh, 1997). El reconocimiento del mecanismo de activación y control de los genes de expresión temprana (IEGs, por ejemplo: c-fos) que parecen mediar en el proceso degenerativo (Hafezi y cols., 1997) ayudará a diseñar estrategias terapéuticas que modifiquen o detengan el curso de la RP. III) Recientemente se ha llevado a cabo la aplicación de Diltiazem, fármaco que actúa bloqueando los canales de calcio tipo L, obteniendo el rescate del fotorreceptor degenerado de la retina del ratón rd (Frasson y cols., 1999). Sin embargo, ningún efecto se ha obtenido en los estudios realizados en la rata que lleva incorporado la mutación Pro23His en rodopsina (Bush y cols., 2000). La conclusión de todo lo anteriormente expuesto, no nos debe hacer adoptar una actitud pesimista en torno a la resolución de la retinopatía pigmentaria. Pero también es fácil comprender que la mayoría de las soluciones vendrán de la mano de un abordaje coordinado del problema por parte de las múltiples disciplinas que interactúan en el estudio de las degeneraciones retinianas. Tan sólo con el esfuerzo de todos se logrará preservar la visión del colectivo de pacientes con RP, objetivo final de nuestros estudios.
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