La retinosis pigmentaria en españA: estudio clínico



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Símbolo Localización Herencia Gen

RP20 1p31 Recesiva RPE65 (retinal pigment


epithelium-specific 65 kD)

RP19 1p21-p22 Recesiva ABCA4 (ATP-binding cassette transporter-retinal)

RP18 1q13-q23 Dominante No

RP12 1q31-q32.1 Recesiva CRB1(crumbs homolog 1)

RP28 2p11-p16 Recesiva No

2q14.1 Recesiva MERTK

RP26 2q31-q33 Recesiva No

2q37.1 Recesiva SAG (s-antigen)

RP4 3q21-q24 Recesiva/ RHO (rhodopsin)
Dominante

4p16.3 Recesiva PDE6B (phosphodiesterase


beta subunit)

4p12-cen Recesiva CNGA1 (rod cGMP gated


channel alpha subunit)

RP29 4q32-q34 Recesiva No

5q31.2-q34 Recesiva PDE6A (phosphodiesterase
alpha subunit)

RP14 6p21.3 Recesiva TULP1 (tubby-like 1)

RP7 6p21.2-cen Dominante/ RDS (peripherin)
Digénica

RP25 6cen-q15 Recesiva No

RP9 7p15-p13 Dominante No

RP10 7q31.3 Dominante No



Símbolo Localización Herencia Gen

RP1 8q11-q13 Dominante RP1 (photoreceptor-specific)

8q13.1-q13.3 Recesiva TTPA (alpha tocopherol transfer)

10q23 Recesiva RGR (RPE-retinal G protein


coupled receptor)

10q24 Recesiva RBP4 (retinol binding protein)

11q13 Dominante ROM1 (retinal outer segment menbrane protein 1)

RP27 14q11.2 Dominante NRL (neural retina leucine zipper)

15q23 Recesiva NR2E3 (nuclear receptor
subfamily 2 group E3)

15q26 Recesiva RLBP1 (cellular


retinaldehyde-binding protein)

RP22 16p12.1-p12.3 Recesiva No

RP13 17p13.3 Dominante No

17q21.1 Recesiva PDE6G (phosphodiesterase


gamma subunit)

RP17 17q22 Dominante No

RP11 19q13.4 Dominante No

RP23 Xp22 Ligada X No

RP6 Xp21.3-p21.2 Ligada X No

RP3 Xp21.1 Ligada X RPGR (retinitis pigmentosa GTPase regulator

RP2 Xp11.3 Ligada X Novel protein similar to human Cofactor C

Xq13.3 Ligada X, con PGK (phosphoglycerate)


miopatía

RP24 Xq26-q27 Ligada X No


El estudio molecular de estos genes ha permitido caracterizar mutaciones en varios genes determinando su participación en la retinosis pigmentaria, e incluso se ha determinado la participación de un mismo gen en patrones de herencia distintos.

Otra característica que se observa es una heterogeneidad alélica, ya que varios genes involucrados en el desarrollo de la RP pueden ser responsables de otras patologías oculares diferentes como puede observarse en la tabla IV-2.

Tabla IV-2.

GEN PATOLOGÍA

RPE65 RP recesiva, Amaurosis congénita de Leber

ABCA4 RP recesiva, Síndrome de Stargardt recesivo

USH2A RP recesiva, Síndrome de Usher recesivo,

SAG RP recesiva, Enfermedad de Oguchi

RHO RP recesiva, RP dominante

PDE6B RP recesiva, Ceguera congénita estacionaria

RDS RP dominante, RP digénica

RGR RP recesiva, Esclerosis coroidal dominante

ROM-1 RP dominante, RP digénica

RLBP1 RP recesiva, Distrofia recesiva de Bothnia

NR2E3 RP recesiva, Síndrome enhanced S-cone


La genética de la RP es muy compleja. Se han descrito todas las formas de herencia posibles, con una gran heterogeneidad entre familias con el mismo patrón de herencia e incluso heterogeneidad dentro de la misma familia. Los avances tecnológicos nos permiten profundizar, tanto en los procesos biológicos que tienen lugar en la transducción visual, como en la estructura y función de los genes candidatos propuestos, esperando en un futuro poder explicar todos los mecanismos que subyacen a la RP. En los capítulos siguientes se ahonda en los distintos patrones de la RP así como en las formas sindrómicas mayoritarias ofreciendo una visión general sobre el tema.

CAPÍTULO V
la retinosis pigmentaria
autosómica dominante


Miguel Carballo
María Martínez-Gimeno
Carlos Reig

Servei de Laboratori. Hospital de Terrassa



V.1.  Introducción

Las enfermedades hereditarias que causan degeneración y disfunción de la retina son extremadamente heterogéneas. La genética de la retinosis pigmentaria es compleja. Se describen tipos de herencia autosómica dominante (RPAD), autosómica recesiva (RPAR), ligada al cromosoma X, formas digénicas e incluso materna, asociada a herencia mitocondrial. Este capítulo se va a referir exclusivamente a las formas no sindrómicas de RP autosómica dominante(Humphries y cols., 1992; Shastry, 1994; Drya and Li, 1995; Ayuso y cols., 1995). Otras formas de herencia se describen en otros capítulos.

La enfermedad RP con un patrón autosómico dominante afecta por igual a varones y mujeres. Se transmite por herencia de generación en generación y los portadores, varones o mujeres, tienen una probabilidad del 50% de transmitirlo a sus descendientes. Este tipo de herencia nos indica que el defecto genético que produce la enfermedad se localiza en uno de los cromosomas no sexuales (autosomas) del paciente (Fishman y cols., 1985).

V.2.  Loci y genes asociados a retinosis pigmentaria autosómica dominante

La retinosis pigmentaria se produce por una alteración en el genoma del paciente. En el caso de RPAD esta alteración debe localizarse en alguno de los autosomas. Desde el punto de vista molecular la alteración genómica que causa la enfermedad se corresponde con un cambio en la secuencia del ADN, que denominamos mutación, en un gen que se expresa en la retina. Uno de los campos fundamentales de investigación de la retinosis se dirige al aislamiento y caracterización de los genes relacionados con la enfermedad.



V.2.1.  Genes candidatos

El gen de la rodopsina (RHO) fue el primer gen caracterizado asociado a la RP (Drya y cols., 1990). Este gen constituye un ejemplo del método del gen candidato. Un gen candidato asociado a RP cumple una serie de condiciones. Como condición necesaria debe expresarse en la retina, preferentemente de forma específica, codificar una proteína con una función relacionada con la estructura y/o fisiología de la retina y especialmente con las células fotorreceptoras. Los genes que cumplen estas condiciones son susceptibles de ser considerados como candidatos en RP.

El gen rodopsina, codifica una proteína opsina que forma el 90% del componente proteico de la membrana externa de los bastones e interviene en el proceso de captación de luz. El gen RHO fue considerado como candidato y analizado en pacientes con RP. Se demostró que en algunos pacientes se presentaban mutaciones en dicho gen que cambiaban la secuencia de la proteína rodopsina. Estas mutaciones heredadas de ascendientes o pasadas a descendientes de la familia, co-segregaban en la familia con la enfermedad. Además, estudios posteriores han demostrado que mutaciones en este gen se asocian generalmente a un patrón de herencia autosómico dominante (revision Drya and Li, 1995).

Otro gen candidato relacionado con RPAD es el gen RDS-periferina. Este gen se caracterizó a partir de su gen homólogo rds (retinal degeneration slow) en ratón. Se aisló el correspondiente gen homologo en humanos (Travis y cols., 1991a, Travis y cols., 1991b) y se consideró como candidato en la RP. Análisis de mutaciones en el gen RDS-periferina en pacientes de retinitis pusieron en evidencia su asociación con RP y, además, con otro tipo de degeneraciones (como las maculares) en la retina. Por homología con la secuencia del gen RDS-periferina se caracterizó otro gen denominado ROM1 (Bascom y cols., 1992). Las mutaciones de este gen no se han demostrado de forma unívoca que estén asociadas ADRP sino que pueden participar mediante un mecanismo digénico con RDS-periferina en RP.

Genes como NRL, CRX que se expresan de forma específica en una retina adulta y están implicados en la regulación de la expresión de genes como rodopsina (Rehemtulla y cols., 1996; Kummart y cols., 1996, Chen y cols., 1997), son también candidatos. Así recientemente el gen NRL se ha demostrado también asociado a RPAD (Bessant y cols., 1999). Otros genes específicos aislados de librerías de retina de función parcial o totalmente desconocida se investigan como posibles genes asociados a la RP.

V.2.2.  Determinación de los loci asociados a la RP

El ligamiento con marcadores genómicos es un método utilizado para determinar el cromosoma y región o lugar (locus) del mismo que ocupa un gen asociado a una enfermedad. La confección del mapa genético y físico realizada en el Proyecto Genoma Humano permite aplicar este método para caracterizar nuevos genes asociados a la RP. Un requerimiento importante en esta metodología, que condiciona su eficacia, es disponer de familias amplias, con varias generaciones de pacientes y no afectos de la enfermedad. El análisis de familias consanguíneas facilita el método de ligamiento especialmente en los genes de carácter recesivo.

En familias RPAD se han podido localizar varios de estos loci que se representan en la tabla V-1. Estas localizaciones, indican que en esa región cromosómica se halla un gen relacionado con la enfermedad. El trabajo posterior, una vez localizada esa región, consiste en el aislamiento del gen y su caracterización mediante análisis de mutaciones como asociado a RP. Un ejemplo de este método lo constituye, en el caso de RPAD, el gen RP1. El locus correspondiente al gen RP1 fue el primero en caracterizarse mediante la técnica de ligamiento en RP (Blanton y cols., 1991). Se localizó en el año 1991 en tres familias en el cromosoma 8 en la región 8q11-q12. Posteriormente en el año 1999 se ha caracterizado el gen RP1 que presenta mutaciones que segregan con la enfermedad en las tres familias. Estudios posteriores en otras familias con RPAD han demostrado que el origen genético de la RP en algunas de ellas se debe a mutaciones en este gen (Sulivan y cols., 1999; Pierce y cols., 1999).

En algunos de los loci de RP representados en la tabla V-1 no se ha completado el trabajo de aislamiento del gen correspondiente. Es más, en algunas familias se ha podido excluir mediante técnicas de ligamiento que el origen molecular de su enfermedad esté asociada a los loci descritos ni a los genes candidatos caracterizados. Esto significa que quedan todavía por descubrir nuevos loci y genes relacionados con la RP.

Tabla V-1. Loci cromosómico de la retinosis pigmentaria autosómica dominante.

Locus Símbolo Gen Enfermedad

1q13-q23 RP18 RPAD

3q21-q24 RP4 RHO RPAD, RPAR

6p21.2-cen RP7 RDS RPAD; ADDM (digénica)

7p13-p15 RP9 RPAD

7q RPAD


9q34-qter RP21 RPAD + sordera

11q13 ROM1 RPAD; (digénica)

17p13.3 RP13 RPAD

17q22 RP17 RPAD

19q13.4 RP11 RPAD

14q11 NRL NRL RPAD

8q11-13 RP1 RP1 RPAD

V.3.  Genes asociados a la retinosis pigmentaria autosómica dominante

V.3.1.  Rodopsina (RHO)

El gen de la rodopsina se localiza en el cromosoma 3 en la región 3q21-q24. Clonado por Nathans and Hogness en el año 1984. Su tamaño es de algo más de 6 kilobases. Su estructura consta de cinco exones interrumpidos por cuatro intrones. En la región 5 del gen se localiza las secuencias del promotor que regulan su expresión específica en los bastones. Factores de transcripción como los codificados por los genes NRL y CRX, asociados también a retinopatías, se unen específicamente a secuencias del promotor de la rodopsina (Kummart y cols., 1996; Chen y cols., 1996).

El gen RHO codifica para una proteína de 348 aminoácidos. Su estructura consta de siete dominios transmembrana, un dominio citoplasmático y un tercer dominio intradiscal (figura V-1). La proteína rodopsina constituye cerca del 90% del segmento externo de los bastones. Se une al cis-retinal mediante el residuo aminoácido Lys 296. En el segmento citoplasmático situado en la región C-terminal la proteína rodopsina es fosforilada reversiblemente en residuos serina y treonina, por la enzima específica rodopsin kinasa, durante el proceso de fototransducción (Chabre and Deterre, 1989).

Se han descrito hasta el momento cerca de cien mutaciones en el gen de la rodopsina que causan la enfermedad retinosis pigmentaria. El capitulo 10 de este libro presenta las mutaciones detectadas en la población española. En la referencia RetNet están listados las mutaciones encontradas en la población mundial. El tipo de mutación encontrado en la rodopsina es principalmente de carácter puntual, es decir que un cambio de residuo nucleótido en la secuencia del ADN. Estas mutaciones en la mayoría de los casos ocasionan el cambio de un aminoácido en la secuencia primaria de la proteína. En algunos pocos alelos se han observado mutaciones del tipo delecciones (falta de nucleótidos en la secuencia de ADN), inserciones o mutaciones puntuales que producen un codon de finalización prematura de la proteína. En todos los casos anteriores se obtiene una proteína anómala no funcional.

La mayoría de los alelos mutantes encontrados en rodopsina producen RP con un patrón de herencia autosómico dominante (RPAD). Sin embargo, se han detectado tres alelos que producen una RP autosómica recesiva (RPAR) (Kumaranickavel y cols., 1992; Rosendfelt y cols., 1992), así como uno que no produce RP sino ceguera nocturna congénita (Dryja y cols., 1993). Esta diferencia de fenotipos nos da idea de la complejidad del mecanismo patológico de la RP.

V.3.2.  RDS-periferina y ROM1

El gen RDS-periferina se aisló y caracterizó a partir de una cepa de ratón denominada rds (retinal degeneration slow). Esta cepa de ratones tiene una inserción de 10 kb en el gen rds que le causa la enfermedad RP. El gen RDS-periferina humano localizado en el cromosoma 6 (6p21) se aisló y caracterizó por el grupo de Travis (1991a). La proteína periferina muestra, con la de ratón, una analogía mayor del 90%.

El gen RDS-periferina tiene una estructura compuesta por tres exones y dos intrones. Se expresa en los conos y en los bastones. Codifica una proteína de 346 aminoácidos que se localiza en el borde externo del disco (Travis, 1991ª y cols., Arikawa y cols., 1992). Su estructura consta de cuatro segmentos transmembrana, un dominio citoplasmático y otro intradiscal (figura V-2).

El gen ROM1 (rod outer segment membrane protein 1) se aisló y caracterizó a partir (Bascom y cols.,1992) de una librería de cADN por su homología de secuencia (35%) con RDS-periferina. El gen ROM1, se localiza en el cromosoma 11 (11p13) su estructura consta de tres exones y dos intrones (Bascom y cols.,1993a). Codifica una proteína que, al igual que la periferina, se localiza en los bordes externos de los discos en conos y bastones. Su estructura proteica al igual que la periferina consta de cuatro segmentos transmembrana. Un dominio estructural citoplasmático y otro intradiscal.

Las proteínas periferina y ROM1 tienen siete cisteínas conservadas en su estructura primaria. Estos residuos Cys tienen un papel importante en el mantenimiento de sus estructuras terciarias y cuaternarias. Así, ambas proteínas forman homodimeros a través de enlaces covalentes por puente disulfuro. Estos homodimeros interaccionan entre sí mediante enlaces no covalentes para formar una estructura tetramérica (Goldberg y cols., 1995; Kedzierski y cols., 1999).

La función asignada a las proteínas periferina y Rom1 es de carácter estructural. La periferina parece implicada en la curvatura periférica de la membrana de los discos y/o en el anclaje de los discos con el citoesqueleto. En mutantes homozigotos de la cepa de ratones rds, se observan defectos en el desarrollo de la membrana externa de los fotorreceptores, por lo que la periferina debe ser esencial para su biogénesis. De la proteína codificada por el gen ROM1 no se conoce todavía su función aunque debido a su interacción in vivo con periferina puede complementar la función de ésta.

Hasta el momento se han descrito más de 40 mutaciones en el gen RDS-periferina en familias con degeneraciones retinianas autosómica dominante (ref RetNet). Sin embargo, estas mutaciones expresan un fenotipo más heterogéneo que el encontrado en el gen RHO. Así, algunas mutaciones inducen un tipo de degeneración retiniana diferente a RP, como distrofias maculares (DM), DM viteliforme, DM en mariposa o fundus flavimaculatus (Wells y cols.,1993, Nichols y cols., 1993; Weleber y cols., 1993). En alguna familia con una mutación (null alelle, alelo nulo, no se produce producto proteico funcional) en el gen RDS-periferina que produce una proteína truncada, semejante a la encontrada en la cepa de ratones rds, produce un fenotipo de retinosis punctata albences (Kajiwara et al., 1994).

Se han detectado mutaciones en el gen ROM1 en familias RPAD. Sin embargo, no se ha podido establecer en ninguna de estas mutaciones una relación unívoca con RP (Bascom y cols., 1993b; Bascom y cols., 1995). Por el contrario, en unas pocas familias se ha demostrado que solamente pacientes que presentan mutación en el gen ROM1 y RDS-periferina expresaban un fenotipo de RP. Este tipo de mecanismo de expresión de la enfermedad se denomina digénico (Kajiwara y cols.,1994, Dryja y cols., 1997) y se describe más adelante.



V.3.3.  NRL y CRX

El gen NRL(neural retina leucine ziper) se aisló a partir de una librería de sustracción de retina como gen específico que se expresaba en retina adulta y células de retinoblastoma, pero no en otros tejidos adultos. El gen NRL se localiza en el cromosoma 14 (14q11). Se ha comprobado que el gen NRL es muy conservado y se expresa en la retina de los vertebrados adultos. La estructura del gen consta de tres exones separados por dos intrones. El primer exon no contiene secuencias que codifiquen para la proteína. Las secuencias que codifican se encuentran en los exones 2 y 3 del gen.(Swaroop y cols., 1992; Farjo y cols., 1995).

La proteína que codifica el gen NRL contiene un dominio básico de unión al ADN y una estructura en cremallera de leucinas (leucina zipper). Su estructura es similar a la de factores de transcripción de la familia de las oncoproteinas jun y fos y presenta una gran semejanza con las proteínas oncogénicas retrovirales de ave v-maf. La proteína que codifica el gen NRL (Nrl) es un factor de transcripción que regula la expresión de la rodopsina en los bastones. Nrl se une de forma específica a la secuencia consenso de ADN: TGCN6-8NGCA. En la región promotora del gen de la rodopsina se localiza una región de unión NRE (Nrl response element) con la proteína Nrl. Esta región se conserva en los promotores del gen Rho bovino y de roedores (Rehemtulla et al., 1996; Kummar y cols., 1996).

El gen CRX (cone-rod homeobox) se expresa mayoritariamente en los fotorreceptores y pinealocitos. Se localiza en el cromosoma 19 (19q13.3). La estructura del gen consta de tres exones y dos intrones. La proteína (Crx) que codifica el gen CRX consta de 299 aminoácidos con un dominio «homeobox» en la región N-terminal. Regula la expresión del gen RHO mediante interacción con su región promotora. En vivo actúa sinérgicamente con Nrl en la regulación del gen de la rodopsina. Además, la proteína Crx regula la actividad transcripcional de otros genes específicos de los fotorreceptores que codifican proteínas como la b-fosfodiesterasa, la proteína receptora de unión de retinol y la arrestina. Su función es importante en la regulación del desarrollo de los fotorreceptores y en la expresión de genes específicos (Chen y cols., 1997).

Recientemente se ha encontrado una mutación en el gen NRL en una familia inglesa (Bessant y cols., 1999) y en una española (Martinez-Gimeno y cols., 2001) con RPAD. Además, se ha encontrado otra mutación en el gen NRL en un caso esporádico (Martinez-Gimeno y cols., 2001). Se han detectado así mismo un número reducido (dos) polimorfismos en la secuencia codificante del gen NRL, lo que indica el grado elevado de conservación de la secuencia.

El gen CRX está localizado en la región cromosómica previamente asociada a distrofia de conos y bastones (CORDII). El análisis de mutaciones en estos pacientes demuestra que mutaciones en el gen CRX segrega de forma autosómica dominante con la enfermedad CORDII (Swain y cols., 1997; Freund y cols., 1997). Además, se han detectado mutaciones en CRX en casos de amaurosis congénita de Leber (Swaroop y cols., 1999). No se ha asociado de forma directa hasta el momento con RP.



V.3.4.  RP1

El gen RP1 (retinosis pigmentaria 1) recibe su nombre por ser un gen localizado en la primera región cromosómica descrita mediante ligamiento de marcadores para la RP (Blanton y cols., 1991). Esta región se expande a lo largo de 4 Mb (mega bases) del cromosoma 8 (8q). Es una región parcialmente equivalente (sinténica) con la del cromosoma 4 de ratón. El uso de EST, que son fragmentos de genes aislados de una librería cADN, en este caso de retina, permitió asignar dos de estos EST a la región de 4 Mb humana y de ratón. La búsqueda del gen correspondiente en una genoteca de levadura permitió clonar el gen RP1. La localización de este gen constituye un ejemplo del método de ligamiento. (Sulivan y cols., 1999; Pierce y cols., 1999).

RP1 es un gen específico de los fotorreceptores cuyo nivel de expresión in vivo está regulado por los niveles de oxígeno en la retina. Su estructura está compuesta por cuatro exones y tres intrones. El cuarto exon es de un tamaño considerable y se extiende a lo largo de 4 kb. El gen codifica una proteína de 2.156 aminoácidos. Su función actualmente se desconoce.

Se han detectado algunas mutaciones relacionadas con RPAD. La mutación en el codon 667 que produce una proteína truncada se ha encontrado en un 3% de las familias RPAD norteamericanas. En España se ha detectado una mutación en el codon 667 en una familia (resultados no publicados), pero no parece ser abundante entre la población. Se han detectado otras pocas mutaciones en este gen en familias RPAD. La mayoría de estas mutaciones dan lugar a la proteína Rp1 truncada (Sulivan y cols., 1999; Pierce y cols., 1999).



V.4.  Diagnóstico Molecular: Análisis
de mutaciones en genes asociados a RPAD

Uno de los objetivos planteados en el campo de la investigación en genética molecular es determinar el origen molecular de las enfermedades. Se sabe que la retinosis pigmentaria es una enfermedad genética hereditaria cuyo origen molecular se encuentra en las mutaciones de genes que intervienen en la estructura y fisiología de la retina, especialmente en su función fotorreceptora. Como ya se ha expuesto anteriormente algunos de estos genes han sido aislados y caracterizados. El diagnóstico molecular en el campo de la retinosis pigmentaria autosómica dominante se dirige a la detección de posibles mutaciones en estos genes en los pacientes de RPAD (Reig y cols., 1995ª; Reig y cols., 1996). El esquema que se sigue para el análisis de las mutaciones se detalla en el recuadro siguiente.

– Extracción de ADN a partir de sangre periférica.

– Amplificación, por reacción en cadena de la polimerasa, de los exones de cada gen estudiado.

– Cribado de mutaciones y polimorfismos mediante las técnicas de DGGE y/o SSCP.

– Secuenciación automática en los casos en los que se detecta un patrón anormal de electroforesis mediante las técnicas citadas anteriormente

– Eventualmente confirmación de la mutación detectada mediante enzimas de restricción.

Mediante la aplicación de las técnicas referidas anteriormente se pueden detectar el 98% de las mutaciones en un gen.

Una vez que se ha detectado una mutación en un gen de un paciente, se extiende el análisis a toda la familia. La segregación de la mutación con la enfermedad confirma si el origen molecular de la enfermedad es la mutación detectada.

En la figura V-3 se presenta un análisis molecular de una familia RPAD en la que una mutación puntual (cambio de un nucleótido en la secuencia de ADN) provoca un cambio de aminoácido en la rodopsina.

En el capitulo 11 se describen las mutaciones detectadas en los genes asociados RPAD en familias españolas. Una lista completa de todas las mutaciones reportadas en RP en la población mundial estudiadas se encuentra en la referencia (RetNEt ).

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