Laboratorio I microscopia



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LABORATORIO I

MICROSCOPIA


INTRODUCCIÓN.
El microscopio es un instrumento óptico que produce una imagen aumentada de los objetos. En los últimos tres siglos ha permitido ampliar el campo de las investigaciones biológicas y se ha convertido en el instrumento básico para establecer nuevas fronteras en la biología. La lupa es el microscopio más simple y fue utilizada inicialmente por algunos investigadores para adquirir los primeros conocimientos del mundo microscópico; posteriormente se perfeccionó y en la actualidad hay varios tipos de microscopios, algunos de ellos altamente específicos, para una gran variedad de usos, tales como microscopio simple, compuesto (invertido, de fluorescencia, de luz ultravioleta, de luz polarizada, de contraste de fase, de campo oscuro) y electrónico (de transmisión y de barrido).

En las prácticas de este curso se utilizaran microscopios compuestos binoculares, en los que se combinan dos sistemas de lentes (el ocular y el objetivo) para obtener las imágenes.


A. OBJETIVOS.
Con esta práctica se pretende que el estudiante:
1. Conozca las diferentes partes del microscopio compuesto binocular y sus respectivas

funciones.

2. Aprenda a manejar correctamente el microscopio compuesto binocular

3. Aprenda a preparar muestras en fresco.


B. MATERIALES


  1. Microscopio compuesto

  2. Portaobjetos

  3. Cubreobjetos

  4. Goteros

  5. Beakers

  6. Toalla de papel adsorbente

  7. Hilos de color

  8. Flores de besito

  9. Flores de lirio

  10. Hojas de guardaparque

  11. Cabellos

  12. Papel delgado con letras impresas por un solo lado

  13. Tijeras

  14. Papel seda para limpiar el microscopio

1. Las partes del microscopio compuesto binocular y sus funciones



Figura 1. Partes del microscopio

b. Descripción y funciones
La mayoría de los microscopios compuestos tienen los mismos componentes básicos. Sin embargo, la disposición de muchos de esos componentes varía según el modelo y la marca, mientras que otras piezas son opcionales. En nuestro caso, nos referiremos al modelo que aparece en la figura 1 que es un Olimpos CH30.
Todo microscopio se compone de una parte mecánica y de una parte óptica. La parte mecánica consta de base o pie, brazo, revolver o disco giratorio, platina, diafragma, tornillos para enfoquen macrométrico, micrométrico o milimétrico. El componente óptico consta del lente condensador, el lente objetivo y el lente ocular.
Base: parte inferior del microscopio, que hace contacto con la mesa. Es su punto de apoyo.
Columna: estructura rígida ubicada en la parte posterior del microscopio, que sostiene sus diferentes partes. En su lado derecho hay un interruptor para prender y apagar el bombillo y, debajo de éste, una perilla reguladora del voltaje, con una escala entre 1 y 5. para prolongar la vida útil del bombillo, se recomienda no pasar del punto 4 elñ voltaje de este sistema
Perilla macrométrica: está en la parte lateral inferior lateral inferior, tanto derecha como izquierda, de la columna y se utiliza para acercar la platina al objetivo y para alejarla. Por medio de estos movimientos suaves de acercamiento o alejamiento de la platina.
Perilla micrométrica: está unida a la micrométrica, en la parte externa de esta. Sirve para obtener el “enfoque fino” o nítido de la imagen mediante movimientos suaves de acercamiento o alejamiento de la platina.
Palanca de freno del enfoque grueso: está ubicada hacia el interior, en la parte izquierda del sistema de perillas macrométrica y micrométrica. Cuando la palanca se mueve hacia abajo, la perilla micrométrica puede subir la platina unicamente
Platina. Lámina cuadrada, con un orificio central, en donde se coloca la muestra que se va a observar.
Carro. Sistema de pinzas ubicado encima de la platina, que sirve para desplazar la muestra en el eje X (o sea, izquierda- derecha) y en el eje Y (o sea, adelante- atrás), mediante las perillas que para tal efecto posee éste.
Diafragma (iris): estructura con apariencia laminar que se emplea para regular el cono de la luz que pasa a través del condensador de abertura y llega a la muestra. El número en la escala de abertura del diafragma, que regula el cono de luz, debe coincidir con la abertura numérica del objetivo. Este ajuste se hace con la palanca que tiene el diafragma al abrirlo y cerrarlo.
Condensadores: hay dos: uno de ellos, es el de abertura, está debajo de la platina y es un sistema de lentes convergentes cuya función es concentrar los rayos de luz en el centro de la platina. Por tanto, sirve para enfocarlos hacia la muestra que se va a examinar. El otro es el campo, que está en la base del microscopio y se utiliza para concentrar la luz que viene de la fuente y para dirigirla hacia el condensador de abertura.
Perilla de la cremallera del condensador de abertura: se utiliza para acercar el condensador de abertura a la muestra, o para alejarla de ella. De esta manera se enfoca el condensador, es decir, se hace converger el cono de luz en el plano de la muestra que se está observando. Está localizado a la izquierda y hacia atrás de este condensador debajo de la platina.
Revólver: sistema giratorio en el que están incorporados los objetivos.
Objetivos: son sistemas de lentes que producen imágenes de la muestra, aumentadas 4, 10, 40 y 100 veces según se indique en los mismos. Al mover en forma circular el revólver, se puede poner cualquier objetivo en posición perpendicular a la platina: Al hacerlo, se nota un tope indicativo de la posición correcta de la lente.
Normalmente, los objetivos tienen información inscrita sobre diversas características propias de cada uno de ellos, como los que se observan en la siguiente imagen.

E: es la referencia de fábrica que identifica a estos objetivos en particular.



A: significa que estos objetivos son acromáticos, es decir, que vienen corregidos para ciertas longitudes de onda ( de los colores verde y rojo en este caso), con el fin de que coincidan en el mismo plano y que, de este modo, la imagen obtenida tenga mejor definición. Algunas lentes, de otros microscopios, vienen corregidas para más de dos longitudes de onda.
Abertura numérica (AN): es la capacidad que tiene el objetivo para recibir el cono de luz que pasa a través de la muestra, procedente de la fuente de luz. La abertura numérica es directamente proporcional al índice de refracción del medio en que se propaga la luz (aire, agua, vidrio, aceite de inmersión), pues mientras mayor sea el índice de refracción, mayor será el cono de luz, lo cual origina un mayor poder de resolución (aspecto que se explicará en la segunda práctica de laboratorio)
Longitud mecánica del tubo: es la distancia que hay entre la parte inferior del objetivo y los oculares. Está indicada en los objetivos y generalmente tiene un valor de 160 mm. Observe cómo al lado de este número , separados por una línea oblicua, aparece un guión o la cifra 0,17. el guión indica que estas lentes pueden usarse para observar muestras sin que sea estrictamente necesario utilizar cubreobjetos; y la cifra 0.17, que solo está en la lente A40, indica que es necesario utilizar un cubre objeto de 17 mm de espesor.
Aumento: cada objetivo tiene un número específico (a,10, 40, 100) que indica cuántas veces se aumenta la imagen del objeto observado. En microscopía se utiliza la letra X para indicar “veces” y por eso se acostumbra, al referirse a un aumento particular, escribir o decir 4X, 10X, etc.
Oculares: son sistemas de lentes cuya función es aumentar la imagen procedente del objetivo tantas veces como indique el número escrito en ellos. 10 en este caso. Los dos oculares pueden moverse hacia los lados y hacia el centro, de manera que se ajusten a la distancia interpupilar de quien esté utilizando el microscopio. Algunos microscopios poseen una sola lente ocular, y por eso se les llama monoculares.
De igual manera que en los objetivos, en los oculares también hay algunas indicaciones, En algunos microscopios ambos oculares tienen inscrito lo siguiente 10X/18L. La cifra de la izquierda (10X) indica el número de veces que cada ocular aumenta la imagen procedente del objetivo; y la derecha (18L) es el llamado número del campo, que sirve para calcular el tamaño del diámetro del campo visual, de acuerdo con el objetivo que se esté utilizando. Este número de campo puede variar según el microscopio de que se trate y normalmente está entre 12 y 36.
Anillo de dioptrías: se ubica en uno de los oculares y sirve para ajustar la visión binocular.
Fuente de luz: proporciona la iluminación necesaria para la observación de la muestra. Algunos microscopios no tienen incorporada la fuente de luz y se valen de un espejo para reflejar la que proviene de un bombillo o de una lámpara.
Poder de resolución: es la capacidad de un sistema óptico para separar el detalle. En la práctica este poder es expresado por el límite de resolución que es la menor distancia que debe existir entre dos puntos para que ellos aparezcan individualizados. El poder de resolución máximo aproximado del ojo humano es cien micrómetros (100 µm), el del microscopio compuesto es de dos décimas de micrómetro (0,2 µm) y el del microscopio electrónico es de una milésima de micrómetro (0,001µm)
Poder de aumento (PA): es el producto del número del aumentos de cada una de las lentes, o sea, el aumento del objetivo (Aob) multiplicado pr el aumento del ocular (Aoc). Su fórmula se expresa así:
(At) = Aob x Aoc
At: es el aumento total Aob: es el aumento del objetivo

Aoc: es el aumento del ocular


Campo visual del microscopio: es el área circular que se observa al mirar a través del microscopio. Varían según las lentes utilizadas.
Unidades utilizadas en mediciones microscópicas: la mayoría de los organismos o estructuras que se estudian al microscopio son de tamaños muy pequeños. Por lo tanto, para medirlos es necesario utilizar unidades reducidas
Unidades utilizadas en mediciones microscópicas: La mayoría de organismos o estructuras que estudian al microscopio son de tamaños muy pequeños. Por lo tanto, para medirlos es necesario utilizar unidades reducidas tales como el milímetro (mm), el micrómetro (µm), el nanómetro (nm) y el angstrom(A°).
Las relaciones que existen entre ellas son:
1 mm = 1000µm 1µm = 1000 nm 1nm = 10A°

2. cuidados que se deben tener con el microscopio.
a. cuando transporte el microscopio cójalo siempre con las dos manos como se indica en la figura.

Figura 3: Manera correcta de transportar el microscopio


b. al poner el microscopio sobre la mesa , sitúelo a unos 10 cm de la orilla.
c. para girar el revólver, utilice la rosca estriada de su parte superior. No lo haga tirando los objetivos hacia la izquierda o hacia la derecha, pues de esta manera se van desajustando los sistemas de lentes y la propiedad parafocal, que es la propiedad de mantener una muestra más o menos enfocada y en el mismo campo focal al pasar de un objetivo a otro.
d. al terminar una práctica de laboratorio siga las siguientes instrucciones.

  1. Retire la placa, o preparación.

  2. Ponga en el punto cero la perilla reguladora del voltaje y proceda a apagar el interruptor (posición O). desconecte del toma corriente el cable de la luz y deje enfriar el bombillo antes de mover el microscopio.

  3. limpie muy bien todas las partes del microscopio, excepto las lentes. Estas sólo deben limpiarse cuando han estado en contacto con aceite de inmersión.

  4. Baje hasta el máximo la platina y deje el objetivo de aumento menor en posición de enfoque.

  5. deje centrado el carro

  6. cubra el microscopio con el forro dispuesto para ello.

  7. deje el microscopio encima de la mesa con la previa revisión del profesor o guárdelo en el armario.

3. Preparación de la muestra en fresco (placa húmeda)


Lave el portaobjeto con jabón y abundante agua, secándolo preferiblemente con un pedazo de tela que no deje residuos encima del vidrio. Con un gotero eche una gota de agua en el centro del portaobjetos y después ponga en ella un pedazo de hilo de color de un centímetro de largo aproximadamente. Apoye luego el cubreobjetos en un ángulo de 45 grados con relación al portaobjetos y sosténgalo con un lápiz, de modo que haga contacto con el agua, como se muestra en la figura 4. Por último, déjelo caer lentamente. De esta manera se evita la formación de burbujas que podrían dificultar la observación. Si queda agua por fuera del cubreobjetos, séquela con papel absorbente. Igualmente, seque el portaobjeto si éste queda mojado por debajo, ya que la humedad lo pega a la platina y le impide desplazarse cuando el carro se mueve.
(Nota: No siempre las muestras en fresco se preparan con agua. En algunos casos es necesario utilizar otras sustancias, o soluciones adecuadas, según el tipo de material que se quiera observar.)



Figura 4: Preparación de una muestra en fresco


4. Observación de una muestra.


De la forma como usted utilice el microscopio depende el éxito de sus observaciones. Por tal motivo se recomienda seguir siempre el procedimiento que a continuación se explica:
a. Colocación de la muestra:
Ponga sobre la platina la placa de hilo que acaba de hacer y fíjela a ella utilizando las pinzas que para el efecto tiene el microscopio. Centre la muestra en el orificio de la platina con las perillas del carro.
b. iluminación del campo visual.
Ponga en posición de observación el objetivo de 4X y abra lentamente el diafragma haciendo coincidir la abertura numérica del objetivo, que para el caso de 4X es de 0,10, con el mismo valor (0.10) en la escala de abertura del diafragma. Suba hasta el tope la platina, sin forzar el sistema, con la perilla macrométrica, y luego, mirando por los oculares, obtenga una iluminación homogénea del campo visual con la perilla reguladora de voltaje.
c. Obtención de la imagen:
Mirando por los oculares, aleje o acerque lentamente la platina con la perilla macrométrica hasta que aparezca la imagen. Si en este momento lo considera necesario, mejore la iluminación con la perilla reguladora del voltaje y con la del condensador de abertura. Moviendo los oculares, ajuste la visión a su distancia interrumpida, igualmente, ajuste la visión binocular con el anillo de diotrias, de la siguiente manera: mire con el ojo derecho por el ocular respectivo, manteniendo cubierto el ocular izquierdo con una hoja de papel o algo similar, y enfoque con la perilla micrométrica lo mejor posible. Ahora proceda a ajustar el izquierdo así: cubra el ocular derecho, mire con el ojo izquierdo por el respectivo ocular y enfoque con el anillo de dioptrías.
Haga un esquema de lo observado, enmarcándolo con un círculo e indicando a un lado el aumento con el que trabajó. Siempre que dibuje un objeto que esté viendo con un microscopio, cumpla esta instrucción. Además indique con flechas y nombres las estructuras que puedan distinguir en él.
d. Uso de objetivos de aumento mayor.
Una preparación siempre se observa con el objetivo de aumento menor, 4X en este caso, para obtener un buen enfoque. La parte que se desea observar con objetivos de aumento mayor debe centrarse en el campo visual.


  • Observación con los objetivos de 10X y 40X.

Siempre que vaya a cambiar de objetivo, ajuste la iluminación con la escala de abertura del diafragma, tal como se explicó antes. Si es necesario, utilice también la perilla reguladora del voltaje.


Gire lentamente el revolver por medio de la rosca estriada de su parte superior, con el fin de poner el objetivo de 10X en la posición adecuada, sin mirar por los oculares. A continuación mire por ellos y, si lo requiere, dele nitidez a la imagen con la perilla micrométrica. Haga un esquema de lo observado y repita el procedimiento, pero utilizando el objetivo de 40X. Compare estas imágenes entre si. ¿Qué relación encuentra entre sus tamaños? ¿A qué se deben esas diferencias?
Haga lo mismo, es decir, enfocar con 4X, 10X y 40X, y dibujar lo observado, con otros materiales que le suministre el profesor: cabellos, granos de polen, epidermis superior o inferior de la hoja de guarda parques, papel milimetrado, etc.
5. Características de la imagen.
a. como se ve la imagen.
Haga una preparación en fresco de una letra asimétrica (no utilice las letras o, x, s, ni las mayúsculas I, H, N, Z). Póngala en la platina en posición normal de lectura y enfoque con el objetivo de 4X. Haga el esquema correspondiente. ¡cómo se ve la imagen con relación a la posición de la letra en el portaobjetos?
Enfoque esa misma letra con el objetivo de 10X y dibújela. ¿ qué proporción aproximada de ella puede ver con relación a la obtenida con el objetivo 4X?
b. Cómo es el desplazamiento de la imagen
Empleando la misma preparación anterior en 10X, desplace el carro hacia la derecha, sin dejar de mirar por los oculares. ¿en qué dirección se mueve la imagen? Desplácelo luego hacia la izquierda y fíjese de nuevo en la dirección en que se mueve la imagen.
Tome ahora la otra perilla del carro y muévalo hacia delante y hacia atrás. Al hacer cada uno de estos movimientos, ¿en qué dirección se desplaza la imagen?

Preguntas de consulta
1. Según los conceptos anteriores, ¿cuántas veces se aumentó el tamaño de la imagen de la letra cuando usted utilizó el objetivo de 4X, 10X y el de 40X, si el ocular de su microscopio era de 10X?
2. ¿Con cuál de los dos objetivos, observa mayor área de una de las letras?. El campo visual de un microscopio es entonces mayor o menor según se observa con mayor o menor aumento. Justifica tu respuesta.
3. Una célula A mide 1x102 µm y una célula B mide 3x103 A°. ¿Cuál de las dos es más pequeña?
4. ¿Qué es y cuál es el índice de refracción del aire, del agua y aceite de inmersión?
5. ¿Qué papel desempeña el aceite de inmersión y por qué se utiliza con el objetivo de 100 X?
6. Si usted va enfocar una muestra, ¿cuál objetivo elije? Dé dos razones que justifiquen su respuesta.
7. Explique el concepto de poder de resolución de un aparato óptico.


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