MicroscopÍa Óptica de super-resoluciÓn: aplicaciones en neurobiologÍa celular



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microscopÍa Óptica de super-resoluciÓn: aplicaciones en neurobiologÍa celular.
Francisco J. Barrantes.
Laboratorio de Neurobiología Molecular, Instituto de Investigaciones Biomédicas (BIOMED), Facultad de Ciencias Médicas, UCA-CONICET, A. Moreau de Justo 1600, 1107 Buenos Aires. rtfjb1@yahoo.com
Hace casi un siglo y medio, el físico alemán Ernst Abbe formuló una ley de la física óptica -la barrera de difracción- que dicta el límite (~200 nm) por debajo del cual no se pueden discernir dos elementos contiguos [1]. En los últimos 50 años ésta ha sido una escala de organización casi exclusivamente abordable mediante microscopía electrónica, que como sabemos requiere, en general, muestras fijadas, deshidratadas y recubiertas de átomos pesados, y que opera en alto vacío. Afortunadamente, desarrollos recientes en microscopía de luz agrupables bajo el término genérico de microscopías de super-resolución o nanoscopías, han permitido sobrepasar tal barrera [2].
Existen dos estrategias generales para implementar las microscopías de luz de super-resolución: a) los métodos nanoscópicos “estadísticos” (es decir, que interrogan simultáneamente poblaciones de moléculas [2, 3] y b) los métodos que interrogan moléculas individuales (“single-molecule localization”). Los primeros requieren que los dos estados distinguibles (“encendido” y “apagado”) de las moléculas fluorescentes completen su ciclo varias veces antes de reducir su emisión por fotoblanqueado [3]. Esto dejar de ser un requisito en la segunda estrategia, cuando se puede discriminar temporalmente cada molécula individual, recolectando la emisión de fluorescencia de moléculas únicas “encendidas” en forma estocástica, mientras que la mayoría de las moléculas permanecen o son llevadas al estado “apagado” [4]. De tal modo, es posible localizar el centroide de la molécula única con precisión nanométrica, por lo general ajustando una función gausiana al punto emisor. Este proceso se repite muchas veces, hasta recolectar un número estadísticamente adecuado de fotones, localizando así suficientes fluoróforos como para generar la imagen de super-resolución con óptica convencional y luz visible [4].
Siguiendo la estrategia indicada en (a), aplicamos la microscopía de super-resolución denominada STED (“stimulated total emission depletion”), revelando por primera vez la organización supramolecular de un receptor de neurotransmisor, el de acetilcolina nicotínico (AChR) de tipo muscular [5] Se pudo discernir nano-acúmulos (“nanoclusters”) de AChR con un diámetro promedio de ~55 nm en la superficie celular. Más recientemente hemos desarrollado métodos de análisis estadísticos para extraer información sobre la organización de estos agregados macromoleculares [6].
En Neurobiología muchos fenómenos de relevancia fisiológica ocurren a escala nanométrica, consecuencia de la citoarquitectura fina del sistema nervioso: la organización de los componentes de la sinapsis obedece a reglas físicas y fisiológicas operativas a nivel de nano-escala.
El advenimiento de las nuevas técnicas de microscopías ópticas de super-resolución ha permitido estudiar estos problemas en neuronas intactas con resolución sin precedentes, abriendo así el acceso al rango de las asociaciones macromoleculares en material fijado, y más recientemente, estudiar su dinámica en células vivas en la escala nanométrica.
La presentación versará sobre aplicaciones recientes de nanoscopías en Neurobiología.

Nano-acúmulos de AChRs resueltos mediante microscopía óptica de STED. Las imágenes 20x20 µm2 (A, C) muestran tres células diferentes fijadas y a posteriori marcadas con mAb210, un anticuerpo monoclonal anti-AChR, y con anticuerpos secundarios conjugadas con el fluoróforo Atto 532. Las imágenes de mayor aumento de las áreas marcadas hacen posible una comparación directa, en el mismo espécimen, de la resolución alcanzada mediante microscopía confocal (B) y STED (D), respectivamente. Reproducido de ref. [5].


Referencias
[1]. Abbe, E. (1873). Archiv für Mikroskopische Anatomie, 9: 413-468.

[2]. Hell, S. W. and J. Wichmann (1994). Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission. Opt. Lett. 19(11): 780-782.

[3]. Eggeling, C., Willig, K.I. & Barrantes, F.J. (2013). STED microscopy of living cells – New frontiers in Membrane and Neurobiology. J. Neurochemistry 126: 203-212. DOI: 10.1111/jnc.12243.

[4]. Willig, K.I. and Barrantes, F.J. (2014). Recent applications of superresolution microscopy in Neurobiology. Current Opin. Chem. Biol. (in press).



[5]. Kellner, R. Baier, J., Willig, K.I., Hell, S.W. and Barrantes, F.J. (2007). Nanoscale organization of nicotinic acetylcholine receptors revealed by STED microscopy. Neuroscience 144, 135-143.

[6]. Wenz, J.J., Borroni, V. and Barrantes, F.J. (2010). Statistical analysis of high-resolution light microscope images reveals effects of cytoskeleton-disrupting drugs on the membrane organization of the nicotinic acetylcholine receptor. J. Membr. Biol. 235:163-175.


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