Índice general



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ÍNDICE GENERAL





Página

ÍNDICE GENERAL………………………………………………………………………........


IV

ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………………


VII

ABREVIATURAS……………………………………………………………………………….


VIII

RESUMEN………………………………………………………………………………………


X

SUMMARY…………………………………………………………………………………......


XI

1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………...


1

1.1. Generalidades…………………………………………………………………………..

1

1.2. Sistemas celulares cardiacos…………………………………………………………

1

1.2.1. Fibroblastos…………………………………………………………………………….

1

1.2.2. Miofibroblastos………………………………………………………………………….

1

1.3. Comportamiento celular……………………………………………………………….

2

1.4. Sistema renina angiotensina aldosterona……………………………………………

4

    1. SRAA en fibroblastos y miofibroblastos……………………………………………...




5

2. HIPÓTESIS………………………………………………………………………………….


7

3. OBJETIVOS…………………………………………………………………………………


7

4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………………………………


7

5. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………………


8

5.1. Reactivos………………………………………………………………………………...

8

5.2. Modelo animal………………………………………………………………………......

8




Página

5.3. Aislamiento y cultivo de fibroblastos cardiacos de ratas neonatas……………….

8

5.4. Desdiferenciación de fibroblastos cardiacos a miofibroblastos……………………

9

5.5. Tinción de células con cristal violeta………………………………………………….

9

5.6. Ensayo de migración celular…………………………………………………………..

9

5.7. Transducción adenoviral……………………………………………………………….

10

5.8. Ensayo de proliferación………………………………………………………………...

10

5.9. Ensayo de adhesión…………………………………………………………………….

11

5.10. Ensayo de contracción de geles de colágeno.………………………………………

11

5.11. Preparación de extractos celulares totales………………………………………......

11

5.12. Preparación de medio de cultivo celular…………………………………………......

12

5.13. Electroforesis de geles de poliacrilamida en condiciones desnaturantes…………

12

5.14. Electrotransferencia de proteínas……………………………………………………..

13

5.15. Western Blot……………………………………………………………………………..

13

5.16. Zimografía………………………………………………………………………………..

14

5.17. Microscopía de transmisión y de epifluorescencia…………………………………,

14

5.18. Análisis estadístico…………………………………………………………………......


15

6. RESULTADOS……………………………………………………………………………...


16

6.1. Evaluación de desdiferenciación de FCN a MCN por efecto de TGF-β1…..............

16

6.2. Evaluación del efecto de Ang II sobre la proliferación y migración de MCN que sobre expresan el AT1R………………………………………………………………...

17


6.3. Efecto de Ang II sobre adhesión de MCN transducidos con AdAT1R…………………………………………………………………………………..

20





Página

6.4. Efecto de Ang II sobre contracción de MCN transducidos con AdAT1R…………………………………………………………………………………...

22


6.5. Efecto de Ang II sobre expresión y secreción de proteínas de matriz en MCN transducidos con AdAT1R………………………………………………………..

23


6.6. Efecto de Ang II sobre actividad de MMP-2 en MCN transducidos con AdAT1R…………………………………………………………………………………...

26


7. DISCUSIÓN……………………………………………………………………………….


27

8. LIMITACIONES DEL ESTUDIO………………………………………………………….


34

9. CONCLUSIONES………………………………………………………………………...


36

10. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………...


37


ÍNDICE DE FIGURAS







Página

Figura 1

Comportamiento celular: migración, adhesión, proliferación y secreción de proteínas de la MEC: modelo del rol de fibroblastos y miofibroblastos durante la cicatrización de una herida…………………………………………..

4

Figura 2

Desdiferenciación de fibroblastos cardiacos a miofibroblastos………………

16

Figura 3

Curva de incorporación de [H3]-Timidina………………………………………..

18

Figura 4

Evaluación de proliferación en miofibroblastos cardiacos que sobre expresan el AT1R……………………………………………………………….....

18

Figura 5

Efecto de angiotensina II sobre migración de miofibroblastos cardiacos que sobre expresan el AT1R………………………………………………….............

19

Figura 6

Curva de miofibroblastos cardiacos adheridos sobre plástico………………..

20

Figura 7

Efecto de angiotensina II sobre la adhesión de miofibroblastos cardiacos…

21

Figura 8

Efecto de angiotensina II sobre la adhesión de miofibroblastos cardiacos que sobre expresan el AT1R……………………………………………………..

21

Figura 9

Curva de contracción de geles de colágeno …………………………………...

22

Figura 10

Efecto de angiotensina II sobre la contracción de miofibroblastos cardiacos que sobre expresan el AT1R……………………………………………………..

23

Figura 11

Efecto de angiotensina II sobre la expresión de fibronectina en extracto celular de miofibroblastos cardiacos que sobre expresan el AT1R…………..

24

Figura 12

Efecto de angiotensina II sobre secreción de fibronectina al medio de cultivo celular de miofibroblastos cardiacos que sobre expresan el AT1R….

25

Figura 13

Efecto de angiotensina II sobre expresión de colágeno tipo I en extracto celular de miofibroblastos cardiacos que sobre expresan el AT1R…………..

25

Figura 14

Efecto de angiotensina II sobre la actividad de metaloproteinasa-2 en miofibroblastos transducidos con AdAT1R……………………………………...

26

ABREVIATURAS

-SMA : Alfa actina de músculo liso

AdAT1R : Adenovirus receptor AT1

AdAT2R : Adenovirus receptor AT2

AdGFP : Adenovirus proteína fluorescente verde

Ang II : Angiotensina II

APS : Persulfato de amonio

AT1R : Receptor de angiotensina II subtipo 1

AT2R : Receptor de angiotensina II subtipo 2

Bax : Proteína proapoptótica de la família Bcl-2



BSA : Albúmina de suero de bovino

Bcl-2 : Proteína antiapoptótica de la família Bcl-2

cm : Centímetro

CMV : Citomegalovirus

DMSO : Dimetil sulfóxido

EDTA : Acido etilendiaminotetraacético

EGTA : Ácido etilén glicol-bis(-aminoetil eter)-N,N,N’,N’-tetracético

FBS : Suero fetal de bovino

FCN : Fibroblastos cardiacos neonatos

FCN-AdAT1R : Fibroblasto cardiaco neonato transducido con AdAT1R

FN : Fibronectina

Fig : Figura

GFP : Proteína fluorescente verde

h : Hora


HA : Hemaglutinina

HEPES : Acido N-2-hidroxietilpiperazina N-2-etanosulfónico

JNK : Kinasa N-terminal de c-Jun

kDa : Kilo dalton

Los : Losartán

MAPK : Proteína quinasa activada por mitógenos

MCN : Miofibroblasto cardiaco neonato

MCN-AdAT1R : Miofibroblasto cardiaco neonato transducido con AdAT1R

MEC : Matriz extracelular

min : Minuto

mg : Miligramo

mL : Mililitro

mM : Milimolar

mm : Milímetro

MOI : Multiplicidad de infección

MTT : Bromuro de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio

NaCl : Cloruro de Sodio

NaOH : Hidróxido de sodio

Na3VO4 : Ortovanadato de sodio

nm : nanómetros

nM : nanomolar

nmoles : nanomoles

PBS : Tampón fosfato salino

PLC : Fosfolipasa C

pmoles : picomoles

PMSF : Fenilmetilsulfonifluoruro

PKC : Proteína kinasa C

p/v : Porcentaje peso volumen

rpm : Revoluciones por minuto



s : Segundos

SD : Desviación estándar

SDS : Dodecil sulfato de sodio

SDS-PAGE : Gel de poliacrilamida denaturante

SEM : Error estándar de la media

TBS : Tampón tris salino

TCA : Acido tricloro acético

TGF- Factor de crecimiento transformante beta 1

TEMED : N,N,N´,N´-tetrametil-etilendiamina

Tris : Tris-(hidroximetil)-aminoetano

µg : Microgramo

µl : Microlitro

µM : Micromolar

µm : Micrómetro

WB : Western blot

RESUMEN

Angiotensina II modifica el comportamiento celular de miofibroblastos cardiacos de ratas neonatas que sobre expresan el receptor subtipo AT1

Los fibroblastos y miofibroblastos cardiacos son elementos claves en el desarrollo del remodelado cardiaco después de un infarto agudo. Una regulación controlada del crecimiento de la población de fibroblastos y miofibroblastos es importante para una correcta cicatrización y mantención de la función cardiaca. Distintas evidencias muestran que los niveles de angiotensina II (Ang II) y del receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1R) aumentan después del infarto agudo al miocardio. Por esto, falta saber que funciones pueden ser reguladas por Ang II en estas células post-infarto al miocardio cuando se sobre expresan dichos receptores.

Nuestro modelo experimental consideró la sobre expresión del AT1R en miofibroblastos cardiacos de ratas neonatas (MCN) mediante el uso de adenovirus y determinar si Ang II modifica su comportamiento celular y la secreción de proteínas de la matriz extracelular (MEC). Nuestros resultados mostraron que Ang II aumentó la adhesión de las células a proteínas de matriz, como colágeno y fibronectina, y también produjo un aumento en la capacidad contráctil de MCN. Ang II no modificó la proliferación y migración celular, sin embargo, al sobre expresar el receptor AT1, observamos que Ang II disminuyó la viabilidad celular, la cual ocurrió luego de 48 h de transducción, afectando la migración, proliferación, contracción y adhesión celular. Por otra parte, Ang II estimuló la secreción de proteínas de matriz, colágeno tipo I y fibronectina, aumentando su expresión al sobre expresar el AT1R en MCN. Además se observó que Ang II disminuyó la actividad de metaloproteinasa-2 (MMP-2) en MCN que sobre expresan el receptor AT1, resultado que junto con el anterior nos indica que se favorece la deposición de proteínas de matriz, aumentando la secreción y disminuyendo su degradación.

Los resultados obtenidos muestran que Ang II a través del AT1R regula en el miofibroblasto la secreción de proteínas de matriz, disminuyendo su degradación, promoviendo la adhesión a proteínas de la MEC y aumentando la contracción de MCN, todas funciones que apuntan a la reparación del tejido cardiaco después de un infarto.



SUMMARY

Angiotensin II modifies cell behavior of neonate rat cardiac myofibroblasts that over-express subtype AT1 receptor

Cardiac fibroblasts and myofibroblasts are key elements of the development of cardiac remodeling after myocardial infarction. A tight regulation of fibroblast and myofibroblast growth is important to a correct wound healing and to maintain cardiac function. Several lines of evidence have showed an increase in angiotensin II (Ang II) and AT1R levels after myocardial infarction. Thus angiotensin II may play a pivotal role in the regulation of number and function of theses cells.

Our experimental model considered over-expressing AT1R in neonatal rat cardiac myofibroblats (MCN) using adenovirus and to evaluate whether Ang II modifies cell behavior and extracellular matrix (ECM) proteins secretion. Our results show that the stimulation with Ang II increased the adhesion of the cells to ECM proteins, as collagen and fibronectin, and also produced an increase in MCN's contractile capacity. Ang II did not modify proliferation and cellular migration; nevertheless, in MCN over-expressing AT1R, we observe that Ang II diminished cellular viability, which happened after 48 h of transduction, affecting the migration, proliferation, contraction and cellular adhesion. On the other hand, Ang II promoted the secretion of ECM proteins, collagen type I and fibronectin, increasing their expression in MCN over-expressing the AT1R. In addition we observed that Ang II diminished the activity of metalloproteinase-2 (MMP-2) in MCN that over-express the AT1 receptor, and this together with the previous result, indicates that the deposition of ECM proteins is favored, increasing the secretion and diminishing their degradation.

The obtained results demonstrate that the myofibroblast is a key piece in wound healing after myocardial injury, and that Ang II regulates great part of this process, via AT1 receptor, increasing the secretion of ECM proteins and diminishing their degradation, promoting the adhesion to ECM proteins and increasing MCN's contraction, all functions that point at the repair of the cardiac tissue after a heart attack.









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