Primer parcial conceptos previos



Descargar 230.79 Kb.
Página3/6
Fecha de conversión29.01.2017
Tamaño230.79 Kb.
1   2   3   4   5   6

Tecnicas de estudio

El objetivo es alcanzar la pureza deseada con el mayor rendimiento posible. El aislamiento de una molécula se logra a partir de las propiedades fisicoquímicas y biológicas de la misma.



Fases de la purificación

  • Preparación, extracción y clarificado: Se obtiene la biomasa y se produce el disgregamiento celular mediante lisis (ruptura de células sin pared celular en medio hipotónico) o mediante un mortero o sonicacion. Es importante tener en cuenta el pH ya que podrían romperse proteínas, la temperatura y presencia de proteasas (a baja temperatura hay menos velocidad de reacción de las proteasas), la fuerza iónica, etc.



  • Captura: Mediante centrifugación diferencial se obtienen fracciones celulares. Se distinguen el sobrenadante (macromoléculas) y el pellet (restos celulares grandes).



  • Purificación intermedia: Puede ser por salting – out o por diálisis. La primera es una técnica de precipitación diferencial a elevadas concentraciones salinas. Aprovecha la diferencia de solubilidad de las distintas proteínas. Luego se separan por centrifugación a baja velocidad.

Diálisis es una técnica de separación por tamaño. El extracto parcialmente purificado se coloca en una membrana que permite el paso de moléculas pequeñas.

  • Refinamiento: Puede ser por cromatografía en columna o por electroforesis. La primera es un método físico de separación de mezclas por el principio de retención selectiva. Hay una fase móvil y una fase estacionaria. Existen cuatro tipos:

Exclusión molecular cuyo principio de separación es por tamaño.

Intercambio iónico cuyo principio de separación es por carga.

Afinidad cuyo principio de separación es la bioafinidad (alta pureza en menos pasos).

Interacción hidrofóbica cuyo principio de separación es por hidrofobicidad.

Electroforesis es una técnica de separación de moléculas con carga en una matriz porosa bajo la aplicación de un campo eléctrico. La matriz es un polímero entrecruzado de tamaño regulable. El principio de separación es por carga y tamaño. El revelado se hace con agentes intercalantes que se insertan entre las bases de ADN o ARN. Hay dos tipos principales de electroforesis:

Electroforesis en gel de agarosa: Corrida horizontal (matriz sostenida por enlaces no covalentes). Para separación de polinucleótidos. Preparativa o cuantitativa. Debo colocar un buffer de corrida.

Electroforesis en gel de poliacrilamida: Corrida vertical. Separación de proteínas y oligonucleótidos pequeños. Preparativa o cuantitativa y con mayor resolución. En moléculas de ADN la carga es proporcional al tamaño, a mayor cantidad de bases más carga negativa. Para obtener este efecto en proteínas se usa SDS. Como este detergente tiene carga negativa, al unirse a una parte hidrofóbica y formar una hidrofílica compensa la relación carga – tamaño. Hay que tener en cuenta que el SDS rompe los enlaces disulfuro.

Cromatografía en columna



SEGUNDO PARCIAL



El ciclo celular

La división de todas las células ha de ser finamente regulada y coordinada con el crecimiento celular y con la replicación del ADN, para asegurar la formación de una progenie de células que contengan sus genomas completos. En las células eucariotas, la progresión a lo largo del ciclo celular la controla una serie de proteínas quinasas que se han conservado desde las levaduras hasta los mamíferos.

El ciclo celular se divide en dos etapas fundamentales: mitosis e interfase.

Durante la interfase los cromosomas se descondensan y se distribuyen por el núcleo, por lo que el mismo presenta un aspecto uniforme. Sin embargo, a nivel molecular, en la interfase es cuando ocurren el crecimiento celular y la replicación del ADN de manera sucesiva, lo que deja a la célula preparada para la división.

El ciclo de las células eucariotas se divide en cuatro fases diferenciadas. La fase M del ciclo corresponde a la mitosis a la que suele seguir la citocinesis. A esta fase le sigue la G1 (Gap 1) que corresponde al intervalo entre la mitosis y el comienzo de la replicación del ADN. Durante G1 la célula es metabólicamente activa y está creciendo, pero no replica su ADN. Seguidamente tiene lugar la fase S, durante la cual se produce la replicación del ADN (además sigue creciendo la célula). Tras finalizar la síntesis del ADN se produce la fase G2 durante la que prosigue el crecimiento de la célula y en la que se sintetizan proteínas en preparación para la mitosis.

Algunas células del animal adulto cesan por completo su división (como las células nerviosas) y muchas otras solo se dividen ocasionalmente, cuando es necesario reemplazar la perdida de las células debido a una lesión o a la muerte celular. Por ejemplo, fibroblastos de la piel, células del hígado, riñón o pulmón. Estas células salen de G1 para entrar en un estado de reposo del ciclo denominado G0, en el que permanecen activas metabólicamente pero no proliferan a no ser que sean requeridas para ello mediante las señales extracelulares apropiadas.

Distintas parejas constituidas por ciclinas y proteína quinasas relacionadas con Cdk 1 regulan la progresión a través de las etapas del ciclo. La actividad de las Cdk se regula mediante su asociación con las ciclinas, mediante fosforilaciones activadoras e inhibidoras, y mediante la unión de inhibidores de Cdk.

La progresión de las células a través del ciclo de la división celular también se regula por señales extracelulares del medio, así como por señales internas que supervisan y coordinan los diversos procesos que tienen lugar durante las diferentes fases del ciclo celular. Esto se consigue mediante una serie de puntos de control que regulan la progresión a través de las diferentes fases del ciclo celular.

Uno de los puntos de regulación principales del ciclo celular, en muchos tipos celulares, se encuentra avanzada la fase G1, y controla el paso de G1 y a S. Este punto de regulación se definió por primera vez en estudios de levadura de gemación, donde se le conoce como START. Una vez que las células han rebasado el START, quedan determinadas a entrar en la fase S y a sufrir un ciclo de división celular. Sin embargo, rebasar el punto START es un proceso que esta finamente regularizado en el ciclo celular de la levadura, siendo controlado a través de señales externas, como la disponibilidad de nutrientes, y por el tamaño celular. Además de servir como un punto de decisión para supervisar señales extracelulares, START es el punto en el que se coordina el crecimiento de la célula con la replicación del ADN y con la división celular.

La proliferación de la mayoría de las células animales se regula en la fase G1 del ciclo celular. Concretamente, un punto de decisión de la G1 avanzada, denominado punto de restricción en las células animales, funciona de manera análoga a como lo hace START en las levaduras. Sin embargo, a diferencia de las levaduras, el paso de las células animales a través del ciclo celular se regula, principalmente, por factores de crecimiento extracelulares que son señales de proliferación celular, en vez de por la disponibilidad de nutrientes.

En presencia de los factores de crecimiento apropiados, las células atraviesan el punto de restricción y entran en la fase S. Si los factores de crecimiento adecuados no están disponibles en G1, la progresión a través del ciclo celular se para en el punto de restricción. La célula entra en un estado de reposo del ciclo celular (G0) en el que puede permanecer indefinidamente sin proliferar.

Cabe destacar que algunos ciclos celulares se controlan, en cambio, en G2.

Los sucesos que tienen lugar durante las diferentes etapas del ciclo celular han de coordinarse entre sí de tal manera que ocurran en el orden adecuado. Por ejemplo, la célula no debe entrar en mitosis hasta haber finalizado la replicación del genoma. En la mayoría de las células, esta coordinación entre las diferentes fases del ciclo celular depende de un sistema de puntos de control que previenen la entrada en la siguiente fase del ciclo celular hasta que los eventos de la fase precedente hayan sido completados.

Varios puntos de control de daños al ADN garantizan que el ADN dañado no se replicará ni se transmitirá a las células hijas. Estos detectan secuencias de ADN dañado o replicado parcialmente y coordinan la progresión del ciclo celular para completar la replicación o reparación del ADN. Por ejemplo, el punto de control en G2 impide el comienzo de la mitosis en tanto la célula no haya completado la replicación o reparado lesiones existentes. De esta manera similar, en G1 se repara cualquier lesión en el ADN con anterioridad al inicio de la fase S, en la que se replicaría el ADN dañado.

Otro punto de control importante tiene lugar al final de la mitosis. Este supervisa que los cromosomas se alineen de manera correcta en el huso mitótico, lo que asegura que se distribuya un juego completo de cromosomas a cada célula hija.

Existe una familia de proteínas (denominadas proteínas MCM) que se unen a los orígenes de replicación junto con las proteínas del complejo del origen de replicación (ORC). Estas proteínas MCM se encargan de regular y restringir la replicación del ADN a una vez por ciclo celular.

La fase M es en la que se produce la reorganización de casi todos los componentes de la célula. Durante la mitosis (división nuclear) los cromosomas se condensan, la envoltura nuclear de la mayoría de las células se desintegra, el Citoesqueleto se reorganiza para formar el huso mitótico y los cromosomas migran a polos opuestos. Tras la segregación de los cromosomas se suele producir la división de la célula (citocinesis).

La mitosis se divide en cuatro etapas: Profase, metafase, anafase y telofase.

El comienzo de la profase queda determinado por la aparición de los cromosomas condensados, cada uno de los cuales está constituido por dos cromátidas hermanas (las moléculas de ADN hijas que se produjeron en la fase S). Las cromátidas hermanas condensadas se mantienen unidas a través del centrómero, región cromosómica a la que se unen proteínas dando lugar al cinetocoro (lugar de anclaje de los microtúbulos del huso). Además, durante la profase se producen cambios en el citoplasma que conducen al desarrollo del huso mitótico. El huso mitótico está compuesto por microtúbulos que forman dos tipos de fibras: fibras polares y fibras cinetocóricas, que se extienden desde cada polo hasta insertarse en los cinetocoros de los cromosomas duplicados.

La mayor parte de los dímeros de tubulina que forman los microtúbulos del huso, provienen del citoesqueleto que se desarticula al comienzo de la mitosis. Después de la división celular, el huso se desarma de nuevo, el citoesqueleto se reorganiza y la célula adopta su configuración de aparente reposo.

Los centrosomas (que se duplicaron en la interfase) se separan y migran a lados opuestos del núcleo. Ahí actúan como los dos polos del huso mitótico, que comienza a formarse durante la profase tardía.

En los eucariotas superiores el final de la profase se corresponde con la rotura de la envoltura nuclear. Sin embargo, algunas eucariotas unicelulares sufren mitosis cerrada en la que la envoltura nuclear permanece intacta.

Una vez terminada la profase, la célula entra en prometafase. Durante esta, los microtúbulos del huso mitótico se anclan a los cinetocoros de los cromosomas condensados. Los cinetocoros de las cromátidas hermanas se disponen a los dos lados opuestos del cromosoma, por lo que se unen a los microtúbulos que surgen de los polos opuestos del huso.

Los cromosomas se mueven hasta que se alinean en la placa metafásica en la mitad del huso. Llegado a este punto, la célula ha alcanzado la metafase.



La transición de metafase a anafase se produce por la rotura de la unión entre las cromátidas hermanas, las cuales se separan migrando a polos opuestos del huso.

La mitosis finaliza con la telofase, durante la cual los núcleos se regeneran y los cromosomas se descondensan. La citocinesis normalmente comienza durante la anafase tardía y se completa al final de la telofase, dando lugar a dos células hijas en interfase.

Normalmente, tras la conclusión de la mitosis se produce la citocinesis. Esta suele comenzar, en la mayoría de los casos, en la anafase tardía y se desencadena por la activación del Cdk 1. La citocinesis de las células animales se produce mediante un anillo contráctil de filamentos de actina y miosina II que se forma debajo de la membrana plasmática. La célula finalmente se divide por un plano que atraviesa la placa de metafase perpendicular al huso.

A medida que los filamentos de actina y miosina se contraen, estos tiran de la membrana plasmática, lo que hace que la célula se estrangule y quede dividida en dos. A continuación, se rompe el puente entre las dos células hijas y la membrana plasmática se vuelve a sellar.

El mecanismo de la citocinesis es diferente en células de plantas superiores. En vez de ser estranguladas y divididas en dos por el anillo contráctil, estas células se dividen mediante la formación de nuevas paredes celulares y de nuevas membranas plasmáticas dentro de la célula.





Meiosis:

La reproducción sexual requiere en general de dos progenitores y siempre involucra dos procesos: la meiosis y la fecundación.

Cada organismo tiene un número de cromosomas característico de su especie. Las células sexuales o gametos tienen exactamente la mitad del número de cromosomas que las células somáticas del organismo. El número de cromosomas de los gametos se conoce como numero haploide y el de las células somáticas como numero diploide.

Cuando un gameto masculino fecunda a un gameto femenino, los dos núcleos haploides se fusionan (n + n = 2n). La célula diploide producida por la fusión de dos gametos se conoce como cigoto.

En toda célula diploide cada cromosoma tiene su par. Los pares de cromosomas se conocen como pares homólogos y los miembros de cada para se asemejan en tamaño y forma y también en el tipo de información genética que contienen.

La meiosis además de mantener un número constante de cromosomas de generación en generación, es una fuente de nuevas combinaciones de material genético.

Esta consiste en dos divisiones nucleares sucesivas que da por resultado final 4 células hijas. Cada núcleo hijo contiene la mitad del número de cromosomas presentes en el núcleo progenitor.

La interfase de la meiosis es igual a la de la mitosis.

Las ocho fases de la meiosis son:

Profase I: los microtúbulos del huso se organizan y se extienden radialmente desde los polos de la célula. Se desintegra la envoltura nuclear y se aparean y entrecruzan los cromosomas homólogos.

Metafase I: los pares homólogos se alinean en el plano ecuatorial. La región del centrómero de cada homologo se duplica y las fibras del huso se asocian con los cinetocoros.

Anafase I: los homólogos formados por dos cromátidas hermanas se separan siendo tironeados por las fibras cinetocóricas, sin embargo, las dos cromátidas hermanas de cada homologo no se separan como en la mitosis.

Telofase I: los cromosomas homólogos se han movido hacia los polos.

Según las especies pueden formarse o no nuevas envolturas nucleares y la citocinesis puede ocurrir o no.



Profase II: las envolturas nucleares se desintegran y comienzan a aparecer nuevas fibras del huso.

Metafase II: Las fibras del huso se asocian otra vez a los cinetocoros y se extienden otras fibras del huso.

Anafase II: al igual que en la anafase de la mitosis, las cromátidas se separan una de otra, se mueven hacia uno de los polos.

Telofase II: los microtúbulos del huso desaparecen y se forma una envoltura nuclear alrededor de cada conjunto de cromosomas.

Citocinesis: se produce la división del citoplasma, tal como ocurre luego de la mitosis.20160603_134149

Al comienzo de la profase de la primera división meiótica ocurre un hecho clave para la meiosis: los cromosomas homólogos de acercan y se aparean en el proceso de sinapsis. Mientras los cromosomas homólogos están apareados se produce el entrecruzamiento o crossing over.

En los puntos donde hay entrecruzamiento, un fragmento de cromátida de un homologo se rompe y se intercambia por un fragmento de cromátida del otro homologo. Este mecanismo permite la recombinación del material genético de los dos progenitores

En la imagen se ve la comparación entre la mitosis y la meiosis, partiendo de una célula 2n = 4. Lo obtenido de cada una es:

Mitosis: 2 x (2n = 4)

Meiosis: 4 x (n = 2)



Fotosíntesis

Es el proceso por el cual se transforma la energía lumínica del sol en energía química que puede ser aprovechada.



Alimento: compuesto orgánico que puede ser degradado por un ser vivo para obtener energía y materia prima para sintetizar sus moléculas.

Nutriente: sustancias inorgánicas y agua.

Heterótrofos: se alimentan degradando otros organismos.

Autótrofos: fabrican su propio alimento.

Fase lumínica y fase biosintética: En las reacciones de la fase lumínica, la energía de la luz solar dirige la síntesis de ATP y NADPH, acoplada a la formación de O2 a partir del H2O. En las reacciones de la fase biosintética, el ATP y el NADPH producido en la fase lumínica dirigen la síntesis de glucosa. En las células eucariotas, tanto la fase lumínica como la biosintética tienen lugar en los cloroplastos, (las reacciones de la fase lumínica en la membrana tilacoidal y las reacciones de la fase biosintética en el estroma).

Cloroplastos

Son depósitos de energía, almacenan almidón. Como almacenan tanto hay lípidos (“gotitas de aceite”) repartidos. No todas las células vegetales realizan fotosíntesis (el tallo, por ejemplo).

Los cloroplastos son responsables de la conversión fotosintética de CO2 en carbohidratos. Además, los cloroplastos sintetizan aminoácidos, ácidos grasos y los componentes lipídicos de sus propias membranas.

Transporte de electrones

La luz solar es absorbida por los pigmentos fotosintéticos, siendo las clorofilas los más abundantes en las plantas. La absorción de luz excita un electrón a un estado energético más elevado, convirtiendo así la energía de la luz solar en energía química potencial.

Los pigmentos están organizados en fotosistemas en la membrana del tilacoide. Las numerosas moléculas de pigmento en cada fotosistema actúan como antenas, absorbiendo la luz y transfiriendo la energía de sus electrones excitados a una molécula de clorofila que sirve como centro de reacción.

La clorofila del centro de reacción transfiere a continuación su electrón de alta energía a una molécula aceptora de una cadena de transporte de electrones. Los electrones de alta energía se trasfieren entonces a través de una serie de transportadores de membrana, acoplados a la síntesis de ATP y de NADPH.

La transferencia de electrones esta acoplada a la transferencia de protones a la luz del tilacoide, estableciéndose así un gradiente de protones a través de la membrana del tilacoide. La energía almacenada en este gradiente de protones se obtiene posteriormente por un complejo de proteínas de la membrana del tilacoide, la ATP sintasa, que acopla un flujo retrogrado de protones, a través de la membrana, a la síntesis de ATP.

Una diferencia importante entre el trasporte de electrones en los cloroplastos y en las mitocondrias es que la energía derivada de la luz solar durante la fotosíntesis no solo es convertida en ATP, sino que también se utiliza para generar el NADPH requerido para convertir el CO2 en carbohidratos. Esto se consigue utilizando dos fotosistemas diferentes en la fase lumínica de la fotosíntesis, uno para generar ATP y el otro para generar NADPH. Los electrones se transfieren de forma secuencial entre los dos fotosistemas, interviniendo el fotosistema I para generar NADPH y el fotosistema II para generar ATP.



El flujo de electrones se inicia en el fotosistema II. En este la energía derivada de la absorción de los fotones se utiliza para romper moléculas de agua en oxigeno molecular y protones, con el fin de obtener electrones. Esta reacción tiene lugar en la luz del tilacoide, por lo que la liberación de protones a partir de H2O determina un gradiente de protones a través de la membrana del tilacoide. Los electrones de alta energía derivados de este proceso se transfieren a través de una serie de transportadores a la plastoquinona. Esta trasporta los electrones desde el fotosistema II al complejo citocromo B-F (que es la única bomba de H+), en el que los electrones son transferidos a la plastocianina. De esta manera, el transporte de electrones a través del fotosistema II esta acoplado a la generación de un gradiente de protones, que dirige la síntesis qumiosintética de ATP.

Desde el fotosistema II, los electrones son transportados por la plastocianina (proteína periférica de membrana) hasta el fotosistema I, donde la absorción de otros fotones vuelve a generar electrones de alta energía. El fotosistema I, sin embargo, no actúa como una bomba de protones, sino que utiliza estos electrones de alta energía para reducir el NADP+ a NADPH. La clorofila del centro de reacción del fotosistema I transfiere sus electrones excitados a través de una serie de transportadores hasta la ferredoxina, una pequeña proteína de la membrana del tilacoide que da al estroma. Esta puede formar un complejo con la enzima NADP reductasa, que transfiere los electrones de la ferredoxina al NADP+, generando NADPH, que son utilizados por las enzimas del ciclo de Calvin en el estroma del cloroplasto para convertir CO2 en carbohidratos.

Una segunda ruta de transporte de electrones, denominada flujo cíclico de electrones, genera ATP sin la síntesis de NADPH, proporcionando de este modo ATP adicional para otros procesos metabólicos. En el flujo cíclico de electrones, la energía de la luz obtenida en el fotosistema I se utiliza para la síntesis de NADPH. Por tanto, la transferencia de electrones desde el fotosistema I puede generar ATP o NADPH, dependiendo de las necesidades metabólicas de la célula.


1   2   3   4   5   6


La base de datos está protegida por derechos de autor ©bazica.org 2016
enviar mensaje

    Página principal