Primer parcial conceptos previos



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Ciclo de Calvin

En las reacciones biosintética, el ATP y el NADPH producidos en las reacciones luminosas promueven la síntesis de carbohidratos a partir del CO2 y H2O. Las moléculas de CO2 se añaden una a una al ciclo de Calvin que conduce a la formación de carbohidratos. En total, el ciclo de Calvin consume 18 moléculas de ATP y 12 de NADPH por cada molécula de glucosa sintetizada. Se necesitan dos electrones para convertir cada molécula de NADP+ a NADPH, así que deben pasar 24 electrones por la cadena de transporte de electrones para generar suficiente NADPH para sintetizar una molécula de glucosa. Estos electrones se obtienen de la conversión de 12 moléculas de H2O a seis moléculas de O2, lo que produce la formación de seis moléculas de O2 por cada molécula de glucosa.



En la imagen se muestra la síntesis de una molécula de glucosa a partir de seis moléculas de CO2. Cada molécula de CO2 se añade a la ribulosa 1,5 – bifosfato para producir dos moléculas de 3 – fosfoglicerato. Estas seis moléculas de CO2 conducen, de este modo, a la formación de 12 moléculas de 3 – fosfoglicerato, que son convertidas en 12 moléculas de gliceraldehido 3 – fosfato con un gasto de 12 moléculas tanto de ATP como de NADPH. Dos moléculas de gliceraldehido 3 – fosfato son empleadas a continuación para la síntesis de glucosa y diez moléculas continúan en el ciclo de Calvin para dar lugar a seis moléculas de ribulosa 5 – fosfato. El ciclo se completa entonces con el uso adicional de seis moléculas de ATP para la síntesis de ribulosa 1,5 – difosfato.



Respiración

Glucolisis  Ciclo de Krebs  Fosforilacion Oxidativa





Glucolisis

En este proceso se degrada una molécula de glucosa en una serie de reacciones catalizadas enzimáticamente dando 2 moléculas del compuesto de 3 carbonos llamado piruvato. Parte de la energía libre cedida se conserva como ATP y NADH. El proceso ocurre en el citosol.

La glucolisis está dividida en 2 fases:

1) Fase preparatoria:

Glucosa  Glucosa-6-fosfato (por lo que queda atrapada en la membrana)  Fructosa-6-fosfato  + Pi  Fructosa 1,6 bifosfato  Rotura de un azúcar fosfato de 6 carbonos a 2 azucares fosfato de 3 carbonos = Gliceraldehido 3 - fosfato y dihidroxiacetona fosfato.

Estos son pasos enzimáticos no reversibles.

2) Fase de Beneficios:

(2) Gliceraldehido 3-fosfato  Se oxida y fosforila  2 NADH + H+ y 1,3 bifosfoglicerato 

(2) 3 fosfoglicerato + 2 ATP  2 - fosfoglicerato (2)  fosfoenalpiruvato (2) + Agua  Piruvato (2) + 2 ATP

1) Fosforilacion de la glucosa y su conversión en gliceraldehido-3- fosfato (2)

2) Conversión oxidativa del gliceraldehido-3-fosfato en piruvato con formación acoplada de ATP y NADH.

En total se obtienen 2 moléculas de ATP y 2 NADH+.

El piruvato contiene todavía una gran parte de la energía que se encontraba almacenada.

gluco

Vías del Piruvato

Si no hay oxígeno en el medio, el aceptor final de electrones es un compuesto diferente, esta vía se denomina anaeróbica, en la que encontramos:



En presencia de oxigeno es una respiración aeróbica, que consta de la oxidación progresiva del ácido pirúvico a CO2 y agua.

Paso intermedio: oxidación del piruvato.

Antes de ingresar al ciclo de Krebs la molécula de piruvato debe oxidarse quedando así un grupo acetilo de 2 carbonos. Cada grupo acetilo es aceptado momentáneamente por un compuesto llamado Coenzima A. Esto ocurre en la mitocondria, en el espacio intracelular.

Piruvato  Acetil CoA + CO2

Al encontrarse en un medio aeróbico entonces, entra en el:



Ciclo de Krebs

Al entrar al ciclo de Krebs, que ocurre en la matriz mitocondrial el grupo acetilo se combina con un compuesto de 4 carbonos (oxalacetato) y produce un compuesto de seis carbonos (ácido cítrico). En el curso de este ciclo, cuya función principal es obtener electrones de alta energía en NADH y FADH2, dos de los seis carbonos se oxidan a CO2 y se regenera el ácido oxalacetico y de esta forma se arma un ciclo:



Fosforilacion Oxidativa: Cadena de transporte de electrones

Esto ocurre dentro de la membrana mitocondrial. El Oxigeno es el último aceptor de la cadena de transporte de electrones. O2  H2O

Su objetivo es generar un gradiente, se bombea al espacio intermembranal una gran cantidad de protones esto a su vez, va a generar una fuerza protón- motriz, que impulsara a la ATP-Sintasa a la síntesis de ATP. Únicamente los complejos I, III y IV bombean protones. En el complejo II entra el FADH2 para generar FAD.

ATP Sintasa:

Gracias al gradiente la ATP sintasa utiliza un H+ para lograr un doceavo de vuelta, sus subunidades cuentan con un espacio vacío, otro con ATP y otro con ADP + Pi. Esta vuelta fuerza a un cambio conformacional que desprende el ATP, forma un ATP nuevo (con ADP + Pi) y agrega ADP + Pi en la hendidura vacía.

Neuronas e Impulso Nervioso

Las células nerviosas distan formadas por un cuerpo o soma que contiene al núcleo. El núcleo presenta múltiples prolongaciones cortas, las dendritas, y una prolongación extensa, el axón. Las neuronas reciben información a través de las dendritas, esta información se procesa en el soma y se conduce a lo largo del axón hasta la siguiente sinapsis con otra neurona.



La excitabilidad de los tejidos nervioso y muscular depende de cambios eléctricos que se producen a través de su membrana plasmática. Así, el potencial eléctrico de membrana puede permanecer constante en el tiempo o puede variar y conducirse de un lado a otro de las células excitables como un impulso nervioso.

Cuando las células excitables no están estimuladas se encuentran en un potencial de reposo y cuando están frente a cambios transitorios en respuesta a estímulos se encuentran en un potencial de acción.

El potencial en el reposo a través de la membrana es negativo. La acción continua de los sistemas de transporte activo y pasivo le permite a una célula mantener estados estacionarios. Por ejemplo, a través de canales iónicos específicos de Na+ y K+, se mantiene la concentración de Na+ extracelular mucho mayor que la intracelular y viceversa con K+. La migración iónica se debe a la diferencia de potencial electroquímico del ion entre dos puntos.

El K+ tiene canales abiertos y su gradiente electroquímico favorece su pasaje hacia el exterior. Esta fuga de K+ produce un déficit de cargas positivas en el interior celular y una acumulación de esas cargas en el exterior. Debido a que dentro de la célula predominan las cargas negativas de las proteínas, aminoácidos, nucleótidos, etc., en el potencial de reposo, el interior de la célula es negativo con respecto al exterior.

Cuando un estímulo químico o eléctrico alcanza la membrana y hace que su potencial de membrana supere un potencial umbral determinado, induce la apertura de un gran número de canales de Na+ sensibles al potencial eléctrico, lo cual provoca un aumento repentino de la permeabilidad al Na+. El potencial de membrana cambia con rapidez y se torna a +40mV. Este cambio de potencial de membrana hacia valores positivos se denomina despolarización y constituye la etapa inicial del potencial de acción. El cambio de permeabilidad al Na+ dura aproximadamente 0.5 ms. Luego estos canales pasan a un estado inactivo y así la membrana torna a su estado previo de baja permeabilidad a Na+.

Mientras tanto en respuesta al cambio del potencial hacia valores positivos, aunque más lentamente, otros canales de K+ fueron aumentando la permeabilidad de la membrana al mismo. Como resultado, frente a la salida de cargas positivas acarreadas por el K+, esta entra en una fase llamada repolarización, en la que vuelve a aproximarse al potencial de reposo negativo. Al final se lleva a un breve estado de hiperpolarizacion, para volver a cerrar los canales de K+.

Etapas del potencial de acción:



  • Reposo.

  • Despolarización.

  • Sobreexcitación.

  • Repolarización.

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Propagación del impulso nervioso

Una vez que la inversión transitoria del potencial de membrana se inicia, continúa desplazándose a lo largo del axón (auto propaga), renovándose continuamente (auto refuerza). Esto se debe a que al desencadenarse el potencial de acción por la apertura de canales de Na+ sensibles al potencial eléctrico, la inversión del potencial de membrana también afecta a áreas adyacentes en donde se encuentran canales de Na+ similares.

Los axones largos de los vertebrados por lo general están envueltos en vainas de mielina, formadas por células gliales especializadas. En el sistema nervioso central, ciertas células especializadas, los oligodendrocitos, proveen la vaina de mielina, mientras que en el periférico la forma las células de Schwann.

La vaina de mielina no es simplemente un aislante, su característica más importante es que esta interrumpida a intervalos regulares en los llamados nodos de Ranvier. Solo en los nodos los iones de Na+ y K+ pueden moverse a través de la membrana del axón. Así en las fibras mielinizadas el potencial de acción “salta” de un nodo a otro. Esta conducción saltatoria incrementa en gran medida la velocidad.

Si bien en el axón la conducción puede ser bidireccional, en la naturaleza el impulso nervioso se mueve en una sola dirección desde el cono axonico hacia el teledendron, la arborización terminal de axón. Esto se debe a que el origen de los potenciales de acción se encuentra en la zona inicial del axón. Los canales de Na+, inmediatamente luego de abrirse, pasan a un estado inactivo y debe transcurrir cierto tiempo para que de nuevo estén las condiciones de abrirse. Así el segmento del axón tiene un periodo refractario que dura varios milisegundos.

Sinapsis

Sinapsis eléctrica: Los iones fluyen a través de uniones comunicantes, que se producen entre las membranas celulares de las neuronas involucradas en la unión, estas uniones comunican los citoplasmas de neuronas íntimamente yuxtapuestas (Gap Junctions) y las corrientes iónicas pre sinápticas pueden transmitirse de forma pasiva a la siguiente neurona y regenerar el potencial de acción

Sinapsis Química: Las dos neuronas nunca se tocan, un espacio conocido como hendidura sináptica, separa a la célula que transmite la información de la célula que recibe la información. La información se transmite a través de la hendidura sináptica por medio de moléculas señalizadoras.

Cuando un potencial de acción llega a la terminal axonico, altera el potencial de membrana y se abren entonces los canales de Ca2+ que permite que estos fluyan hacia el interior del axón. Este flujo hace que las vesículas sinápticas se fusionen con la membrana celular y vacíen su contenido de transmisores químicos en la hendidura sináptica. Las moléculas transmisoras se unen con moléculas receptoras, esta unión desencadena una serie de acontecimientos que puede o no disipar un potencial de acción.



Musculo y Placa Neuromuscular

Un musculo consiste en cientos de miles de fibras musculares unidas por tejido conjuntivo. Cada fibra es una sola célula multinucleada y está rodeada por una membrana celular externa, el sarcolema, que posee invaginaciones denominadas tubos T. El sarcolema puede disparar y propagar un potencial de acción.



Dentro del citoplasma de cada fibra muscular hay unas 1000 a 2000 miofibrillas, pequeñas unidades estructurales y funcionales de la fibra muscular. Las miofibrillas- formadas por microfilamentos de actina y miosina- corren paralelas y fuertemente compactadas a lo largo de la célula. Cada miofibrilla está rodeada por el retículo sarcoplasmatico. Los sacos del retículo sarcoplasmatico contienen grandes concentraciones de iones Ca2+.

Las miofibrillas están organizadas en unidades llamadas sarcomeros, los cuales se repiten uno tras otro, en serie dándole al musculo su patrón estirado característico. También hay una proteína de peso molecular muy alto, muy elástica que mantiene en su posición a los filamentos de miosina llamada titina.

Cuando se estimula una fibra muscular y se da comienzo a la contracción muscular, las cabezas de las moléculas de miosina se aproximan al filamento delgado de actina, al cual se unen formando los “puentes cruzados”. Las cabezas describen un movimiento como el de un remo, empujando y deslizando a ambos tipos de filamentos entre sí. El resultado es el acortamiento de las líneas Z que bordean el sarcomero y finalmente, el de toda la fibra muscular.

La hidrolisis del ATP por la molécula de miosina provee la energía para el ciclo de formación de los puentes cruzados entre la cabeza de miosina y el filamento de actina y la rotación de las cabezas de miosina

La regulación de la contracción en el musculo depende de dos proteínas, la troponina y la tropomiosina, y del ion Ca2+.Las moléculas de tropomiosina corren a lo largo de las moléculas de actina del filamento delgado; bloquean así los sitios activos de unión de los puentes cruzados de actina-miosina. Las moléculas de troponina se ubican a intervalos regulares sobra las cadenas de tropomiosina. Frente a la presencia de Ca2+, las moléculas de troponina cambian su conformación, lo cual provoca el desplazamiento de las cadenas de tropomiosina y la exposición de los sitios activos de unión de la actina que permiten la formación de los puentes cruzados.

La disponibilidad de Ca2+ y el consecuente inicio de la contracción dependen de la estimulación del musculo como resultado de una señal recibida desde una neurona motora que secreta acetilcolina activando canales de sodio.

Comunicación Celular

Señalización celular: mecanismos empleados por las células para comunicarse entre sí.

Moléculas de señalización celular: representan información que es enviada de una célula a otra para comunicarse (extracelulares).

Recepción de señales: Depende de proteínas receptoras ubicadas en la membrana que se unen con la molécula señal lo que activa uno o varios caminos de señalización intracelular.

Las proteínas efectoras se encargan de:


  • Alterar el metabolismo (enzimas).

  • Alterar la expresión genética (proteínas de regulación de transcripción).

  • Alterar la forma o movimiento (células del citoesqueleto).

Todo cambio físico o químico es recibido por receptores que desencadenan una respuesta celular.

Transducción de señales

Es la conversión de una señal extracelular (información) en una señal intracelular (respuesta). Es una propiedad universal de las células vivas ya que estas responden a antígenos, hormonas, luz, etc.

Características de la transducción de señales:


  • Especificidad y alta afinidad: Complementariedad reversible y precisa entre la molécula señal y el receptor. Además, los receptores para una señal determinada solo están presentes en ciertos tipos de células. Una misma señal puede tener diferentes significados para diversas células diana.

  • Amplificacion por cascadas enzimáticas: La activación de una enzima primaria cataliza la activación de nucleasas enzimas secundarias, cada una de las cuales activa muchas enzimas terciarias y así sucesivamente. El número de moléculas activadas crece geométricamente.

  • Desensibilización: Cuando una señal está presente continuamente se produce una desensibilización del receptor. La presencia del ligando activa un circuito de retroalimentación que desconecta al receptor.

  • Integración: Es la capacidad del sistema para recibir múltiples señales y producir una respuesta unificada apropiada.

El análisis de Scatchard cuantifica la interacción receptor – ligando. Por ejemplo, se busca medir la afinidad de la adrenalina a un determinado receptor. Primero se introduce una gran concentración de adrenalina marcada (radioactivamente) y se cuantifica la fijación total. Luego se aumenta en gran medida la concentración de la adrenalina no marcada y se cuantifica la fijación inespecífica. Mediante estas dos curvas se puede obtener la fijación específica de la adrenalina al receptor.

Tipos de señales:



  • Señales parácrinas: Una célula libera una señal al medio extracelular que llega a las células vecinas.

  • Señales sinápticas: Neuronas transmiten señal eléctrica por el axón y se liberan neurotransmisores.

  • Señales endocrinas: Viajan por el torrente sanguíneo. Es la comunicación de células muy alejadas entre sí.

  • Contacto dependiente: Es necesario el contacto de las membranas mediante Gap Junctions. Estas conectan eléctrica y metabólicamente a las células. Promueven la rápida propagación de señales. Las células pueden intercambiar iones y pequeñas moléculas solubles. Además pueden responder a señales extracelulares coordinadamente.

Mecanismos de señalización intracelular

Receptores acoplados a proteína G

Las proteínas G son proteínas heterotrimericas, poseen tres subunidades diferentes. En su estado inactivo la subunidad alfa lleva GDP unido. Cuando el ligando se une al receptor, este complejo se asocia con la proteína G y le provoca un cambio conformacional que induce el intercambio de GDP por GTP. La proteína G se desplaza hacia otra proteína de membrana inactiva y se une activándola. Esto provoca que se altere la actividad de dicha proteína y desencadena una respuesta celular.

Tomemos como ejemplo la vía de las adenilil ciclasas (adrenalina)

La adrenalina se une a su receptor específico. El receptor ocupado cambia la conformación de su dominio intracelular que promueve un cambio en la proteína G. La subunidad alfa desplaza el GDP y une GTP. Esto induce la disociación de la proteína G en alfa y beta – gama. Se activa la subunidad alfa y se desplaza hacia la adenilil ciclasa y la activa. La adenilil ciclasa cataliza el ciclado de AMP en AMP cíclico que funciona como segundo mensajero (moléculas que se producen en exceso como respuesta a una señal de afuera). El AMPc activa a la PKA que puede fosforilar sus sustratos. Esta fosforila a la glucógeno fosforilasa b quinasa que inicia el proceso de movilización del glucógeno para satisfacer las necesidades energéticas de la célula, alterando finalmente el metabolismo. Como la subunidad alfa es auto limitante, convierte el GTP unido en GDP auto desconectándose. Se disocia de la proteína a la que se había unido y vuelve a unirse a las otras dos subunidades. De esta forma, la proteína queda desactivada al irse la proteína G. Además, el incremento de AMPc es transitorio porque es transformado en 5’ –AMP por la fosfodiesterasa cerrándose el ciclo de señalización.



Receptores acoplados a enzimas

El mejor ejemplo es el receptor de insulina. La unión de insulina produce la unión de dos receptores formando un dímero. Esto activa la parte enzimática, la tirosina quinasa. Las tirosinas adicionan Pi provenientes de ATP. Ahora la tirosina quinasa puede fosforilar proteínas intracelulares. Se produce una cascada de señalización, una amplificación de la señal y la fosforilacion de proteínas específicas. Luego se traduce la señal del ligando al interior de la célula, se activan vías para la respuesta celular mediante interconexiones entre las vías de señalización. Aquí se lleva a cabo la integración y regulación de múltiples efectos hormonales.



Canales iónicos de compuerta

Células excitables detectan una señal externa, la convierten en una señal eléctrica y la transmiten. La excitabilidad de estas células depende de canales iónicos. Existen canales iónicos dependientes de voltaje (como los que se ubican en los nodos de Ranvier de las células nerviosas) y otros dependiente de ligando (como los que se ubican en el soma de las células nerviosas).



Receptores nucleares

La regulación se lleva a cabo por hormonas esteroides, tiroideas, retinoides y vitamina D. La hormona es transportada por proteínas hacia sus tejidos diana. Difunden a través de la membrana plasmática y se unen a proteínas receptoras específicas en el núcleo. Provoca cambios conformacionales en el receptor y de esta forma se puede unir a secuencias específicas de ADN.



Vía de las guanilil ciclasas

Las guanilil ciclasas son receptores enzimáticos que cuando se activan convierten el GTP en el segundo mensajero GMPc. El aumento de GMPc activa a la proteína PKG la cual fosforila proteínas diana específicas. El NO es una molécula pequeña que difunde por la membrana. Se une al grupo hemo de la guanilil ciclasa activándola. De esta forma se activa la producción de GMPc lo que estimula la PKG produciendo la relajación del musculo cardiaco. Las fosfodiesterasas catalizan la transformación en 5’ – GMP y esto lleva al fin de la señal.



Tecnicas de Biología Molecular II

El siguiente link lleva a un pdf que contiene brevemente explicadas la mayoría de las técnicas de biología molecular: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/23IngenGenet1_23749.pdf



Blotting

Es una técnica que permite la detección de una secuencia determinada en una mezcla compleja resultante de una corrida electroforética.

Hibridación por sondas:

Una sonda es un fragmento de tamaño variable que puede ser ADN o ARN, que se une específicamente por complementariedad de bases a la secuencia que se encuentra en la membrana de nylon junto con cientos de fragmentos más. La sonda hibrida con el fragmento específico. Una característica fundamental de la sonda es que lleva alguna marca para que pueda detectarse la unión y, por ende, identificar la secuencia de interés a la cual se unió. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas para marcar la sonda es la incorporación de un nucleótido radioactivo. Existen nucleótidos comerciales marcados con fosforo radioactivo que al incorporarse en una sonda por diferentes técnicas le permite ser detectada mediante la exposición de la membrana a una placa autorradiografica (como la de los rayos x).

Extracción  Digestión  Electroforesis en gel  Desnaturalización  Transferencia a membrana  Hibridación con sonda radioactiva  Lavado  Revelado

Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar

Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda

Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda



Electroforesis

Electroforesis Cuantitativa: Cuantificar que cantidad tengo en cada banda.

Electroforesis Preparativa: Preparar para un trabajo posterior.

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.

La electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia del ADN recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los polipéptidos, y separar los diferentes polipéptidos resultantes de las variaciones del experimento del ADN recombinante. La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.

SDS-Page

Es una técnica para separar las proteínas de acuerdo a su movilidad electroforética (en función de la longitud de la cadena polipeptídica, masa molecular, modificaciones postraduccionales y otros factores). Gracias al SDS las proteínas se desnaturalizan, perdiendo su conformación tridimensional. De este modo se obtiene un fraccionamiento que obedece a: la diferencia de peso; la longitud de la cadena (tamaño); y la forma de la proteína. Es el método de electroforesis empleado con mayor profusión para analizar proteínas.

La disolución de proteínas que se van a analizar se mezcla en primer lugar con SDS, un detergente aniónico que desnaturaliza las proteínas, eliminando sus estructuras secundaria y terciaria (pero sin alterar los enlaces disulfuro y además confiere una carga negativa a cada proteína en proporción a su masa). Sin SDS, las distintas proteínas que tienen masas moleculares similares migran de forma diferente debido a diferencias en la proporción carga/masa, ya que cada proteína tiene un punto isoeléctrico distinto. Si la electroforesis se realiza así, sin añadir SDS, se habla de PAGE nativa. El problema se resuelve añadiendo SDS, puesto que al unirse y desplegar la proteína, le proporciona una carga negativa casi uniforme a lo largo de la longitud de la cadena polipéptidica.



PCR y otros

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Éstos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar.

  • Aislamiento y multiplicación de fragmentos específicos.

  • Ensayo cíclico, de corta duración, alta especificidad y alta reproducibilidad.

  • Pequeñas cantidades de ADN.

  • Se necesita conocer la secuencia o al menos la secuencia flaqueante.

Elementos necesarios:

  • ADN molde que contiene la región de ADN a amplificar.

  • ADN polimerasa termoresistente.

  • Desoxinucleotidos trifosfato (dNTPs).

  • Dos primers.

  • Una solución buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN pol.

  • Termociclador, mantiene la temperatura necesario en cada etapa que conforma el ciclo.

Un chip de ADN (microarray) es una superficie sólida a la cual se une una colección de fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar el ADN son muy variables y pueden ser de vidrio, plástico e incluso de silicona. Los chips de ADN se usan para analizar la expresión diferencial de genes, y se monitorean de manera simultánea los niveles de miles de ellos. Su funcionamiento consiste, básicamente, en medir el nivel de hibridación entre la sonda específica, y la molécula diana (target), y se indican generalmente mediante fluorescencia y a través de un análisis de imagen, lo cual indica el nivel de expresión del gen.

Un enzima de restricción (o endonucleasa de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a este. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 6 pares de bases, con las que son reconocidos.

Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restricción:


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