Proyectos de investigación en parques nacionales: 2003-2006 identidad y estructura genética de la pardela



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Proyectos de investigación en parques nacionales: 2003-2006





IDENTIDAD Y ESTRUCTURA GENÉTICA DE LA PARDELA

BALEAR (Puffinus mauretanicus)

JAVIER JUSTE1, MERITXELL GENOVART2, DANIEL ORO2, GIORGIO BERTORELLE3, MAITE LOUZAO2, MANUELA.G. FORERO 1 Y J. MANUEL IGUAL2


RESUMEN
La pardela balear (Puffinus mauretanicus) es una de las especies de aves marinas más amenazadas del mundo. En este trabajo nos hemos centrado en la evaluación de la identidad genética de la especie y el estudio de sus niveles de variabilidad genética. Además hemos evaluado otro posible problema gené- tico como es su hipotética hibridación con la especie próxima, la pardela mediterránea (P. yelkouan). Para ello se ha muestreado la casi totalidad de las colonias de la especie y analizado genéticamente dos fragmentos de ADN mitocondrial (aproximadamente 1.200 pb). Se ha comprobado la existencia de haplotipos de ADN característicos de la especie próxima que indican una posible introgresión a nivel mitocondrial, sin que se puedan descartar todavía otros orígenes evolutivos. Esta presencia de haplotipos se concentra casi exclusivamente en Menorca cuyos individuos presentan tamaños corpo- rales inferiores a los del resto de colonias. Sin embargo, las diferencias morfométricas se mantienen independientemente al tipo de haplotipo que presenten los individuos. Probablemente nos encontra- mos frente a un contacto secundario entre las dos especies con una introgresión resultante de un inter- cambio genético antiguo y puntual. El esclarecimiento de este interesante fenómeno evolutivo requie- re profundizar los análisis moleculares y extender los comparativos a otras poblaciones mediterráneas.


No se ha detectado pérdida de variabilidad genética en la pardela balear en relación a otras especies. Sin embargo, y a pesar del comportamiento altamente filopátrico de P. mauretanicus, se ha apreciado una débil estructuración poblacional. Ello podría deberse a una conectividad entre colonias superior a la esperada, aunque puede también estar reflejando una homogenización genética entre colonias, aso- ciada a una expansión demográfica en un pasado reciente. Finalmente, algunas colonias presentan un claro desequilibrio entre las tasas teóricas de inmigración y emigración sugiriendo una posible hetero- geneidad espacial en la calidad de las mismas.
Palabras Clave: Pardela balear, Puffinus mauretanicus, Islas Baleares, Puffinus yelkouan, estructura genética, hibridación, ADN mitocondrial.

SUMMARY
The Balearic shearwater (Puffinus mauretanicus) is one of the most endangered seabirds in the world. In this study, we focus on the assessment of the genetic identity, levels of genetic variability and on an additional




1 Estación Biológica de Doñana (CSIC), Avda. Mª Luisa s/n, Aptdo. 41080 Sevilla

2 Institut Mediterrani d’Estudis Avançats IMEDEA (CSIC-UIB), Miquel Marquès 21, 07190 Esporles, Mallorca

3 Dipartimento di Biologia, Università di Ferrara, Via Borsari 46, 44100 Ferrara, Italia

juste@ebd.csic.es

potential problem as is its hypothetical hybridization with the closest species Mediterranean shearwater (P. yelkouan). For that, we sampled almost all the breeding colonies and studied two fragments of mitochondrial DNA (approx. 1200 bp).We have confirmed the presence of haplotypes typically associated to P. yelkouan that indicate a possible introgression. These haplotypes were found almost only in Menorca’s shearwaters, which are all statistically smaller than those from other Balearic Islands but size reduction occurs in all individuals, independently of the haplotype they have.


Levels of genetic variability found in the Balearic shearwater are quite high in relation to other birds, whereas only a shallow geographic structure was found among colonies. This could reflect either a higher than expected connectivity among colonies and/or a homogeneity due to a recent demographic expansion event. Finally, several colonies show unbalanced theoretical immigration and emigration rates, indicating a possible spatial heterogeneity in their colony quality.
Keywords: Balearic shearwater, Puffinus mauretanicus, Puffinus yelkouan, sibling species, Balearic

Islands, genetic structure, mitochondrial DNA.


INTRODUCCIÓN
En este proyecto se propuso, de forma coordi- nada y complementaria con el anterior, propor- cionar los datos genéticos imprescindibles para conocer la historia evolutiva reciente de la par- dela balear (Puffinus mauretanicus), una de las especies mas emblemáticas de la fauna españo- la. Además nos propusimos proporcionar la información genética básica para organizar una estrategia de gestión adecuada y que garantice la conservación de esta especie altamente ame- nazada en la actualidad (ORO et al., 2004).
Para ello se ha estudiado la estructura poblacio- nal, flujo génico e integridad genética de las poblaciones de la pardela balear en el Parque Nacional de Cabrera y poblaciones aledañas a partir de marcadores de ADN.
La aplicación de técnicas moleculares a la gené- tica de la conservación proporciona una impor- tante guía para la elección de los criterios a seguir para el manejo de especies amenazadas (AVISE 1989, CARVALHO 1998). Existen varias fuerzas contrapuestas cuya resultante determi- na finalmente la estructura genética de una población o especie. La teoría de genética de poblaciones, predice que sin acción de selección natural la variabilidad genética de una pobla- ción aumenta con su tamaño (KIMURA 1983) mientras que su tasa de diferenciación aumenta

de forma inversa al tamaño poblacional. Además, las especies presentan poblaciones a menudo sub- divididas por razones geográficas, ecológicas o de comportamiento que por lo tanto favorecen la diferenciación y/o estructuración genética. Por el contrario, el flujo genético entre grupos conduce a una homogenización del material génico. Por lo tanto, cuando la tasa de intercambio es muy baja o nula, la selección natural y otras fuerzas azarosas como la mutación y la deriva genética determinan una diferenciación genética (HEDRICK 1942, SLATKIN 1987). En aves, las poblaciones de algu- nas especies presentan falta de diferenciación genética que se ha explicado por su capacidad de vuelo y consecuentemente de dispersión (BALL et al. 1988, BURSON 1990, BALL & AVISE 1992, AUSTIN et al. 1994, VAN TREUREN et al. 1999). Sin embargo, otras características específicas como la fidelidad a la colonia (filopatría), la distri- bución a grandes escalas geográficas o separacio- nes históricas entre grupos, etc., pueden determi- nar una diferenciación genética entre poblaciones en otros casos.


En este contexto, las pardelas son unas aves mari- nas extraordinarias en muchos aspectos. Su adap- tación a este particular medio es tal que solo acu- den a tierra para realizar sus puestas, y no todos los años. En el medio marino realizan desplaza- mientos extraordinariamente largos. Esta ‘auto- ecología’ tan especial, determina que el estudio de estas aves constituya un enorme reto y ayuda a



entender el enorme desconocimiento que se tiene incluso de aspectos básicos de su biología. Además, la existencia de una uniformidad nota- ble en los patrones morfológicos y de plumaje, ha determinado que la sistemática de las pardelas se haya mantenido confusa hasta nuestros días. En efecto, el propio reconocimiento de la pardela balear a nivel específico ha tenido que esperar hasta finales de los 90 y hasta entonces, su historia ha estado asociada a la pardela mediterránea (P. yelkouan), especie de menor tamaño y mucho más abundante. La distinción de la forma balear res- pecto a la forma mediterránea se basa en caracte- res externos (el color ventral del plumaje no es blanco puro), morfométricos (la forma balear es significativamente mayor en todas las medidas corporales) y ecológicos (patrón de muda diferen- te entre ellas). La recopilación de todas estas dife- rencias apoyó la distinción específica entre ambas formas (MAYOL 1997). Esta distinción recibió el espaldarazo definitivo con un estudio genético del grupo (HEIDRICH et al. 1998), encontrándose valores de distancia genética entre las dos formas mediterráneas similares a los existentes entre otras especies reconocidas en el grupo.

La pardela balear, está considerada un endemis- mo en peligro de extinción. Es de gran importan- cia por lo tanto, establecer su diagnóstico genético y determinar el nivel de variabilidad genética de sus poblaciones y colonias y la tasa de flujo gené- tico entre las mismas. Este ha sido el objetivo de este proyecto que se ha basado en el análisis de dos fragmentos de ADN mitocondrial, unos 1.000 pares de bases del gen citocromo b (cit-b) y unos

300 pares de bases de la región control (RC). Además, se ha empezado un estudio nuclear con la amplificación de 8 loci microsatélites que per- mitirán un estudio futuro complementario y basa- do en ADN nuclear del que no se tiene todavía resultados.

MATERIAL Y MÉTODOS


Recogida de muestras
Se han muestreado prácticamente la totalidad de las colonias conocidas de P. mauretanicus en el

archipiélago balear. En cada una de ellas se tomaron muestras de sangre de adultos y pollos. Para establecer niveles comparativos, también se obtuvieron muestras de la especie próxima P. yelkouan en la isla de Cerdeña y en Marsella. Los tamaños de muestra analizados por colonia o sub- colonia se presentan en la Tabla 1. Concretamente del Parque Nacional de Cabrera se tomaron muestras de tres colonias distintas: ‘Es Corral’ (9 muestras), ‘Llumeta’ (5 muestras) y ‘Es Blanquer’ (35 muestras). En general, las muestras se toma- ron a partir de una punción en la vena femoral del ave y posterior, captación de la gota de sangre bien por capilaridad o con jeringa. La muestra de sangre obtenida era a continuación transferida a un tubo con etanol, puro o al 70%.


Extracción de ADN y amplificación de marcadores


En el laboratorio se procedió a la extracción de ADN de un total de 225 individuos procedentes de distintas colonias (tabla 1) siguiendo un proto- colo que consistió en la incubación a 55º C en tam- pón SET, con 30 ml SDS al 10% y 2.5 unidades /ml de proteinasa K. A las 24 horas se procedió a la extracción de ADN con fenol / cloroformo están- dar (SAMBROCK et al. 1989), resuspendiéndose el ADN obtenido en tampón TE.

L O C A L I D A D A n t e r i o r 2 0 0 3 2 0 0 4 2 0 0 5 T o t a l a 2 0 0 3




Sa Cella




14

1




15

Conills, Malgrats

10

10

2




22

Menorca

7

7

12




26

Espardell

4




2

5

11

Blanquer, Cabrera







13

22

35

Llumeta, Cabrera







5




5

Es Corral, Cabrera







1

8

9

Dragonera







3

7

10

Conillera, Eivissa




7

13




20

Es Bosc, Eivissa







3

17

20

Espartar, Eivissa










12

12

Tavolara, Sardegna










12

12

Figarolo, Sardegna










3

3

Marsella










25

25

Total

21

38

55

111

225

Tabla 1. Colonias y muestras analizadas de la pardela balear (Puffinus mauretanicus) y de la especie próxima pardela medite- rránea (Puffinus yelkouan).

Table1. Description of colonies and individuals sampled of P. mauretanicus and P. yelkouan.





Para la amplificación de un fragmento del gen mitocondrial cit-b, se utilizaron los pares de primer mt-A (L-14970) y mt-Fr (H-16086) (HEIDRICH et al.

1998). Las amplificaciones se efectuaron en un volumen total de 25 µl con: 1mM de cada primer,

0.25 mM dNTP, 1x Taq buffer, 1 U de Taq DNA polimerasa (Bioline), 0.01% gelatina (USB), 2.5 mM de Cl2Mg y 1-2 µl de ADN. Las condiciones de amplificación fueron: desnaturalización inicial a

94º C 1 min, seguido de 35 ciclos de 94 ºC 1 min., 50º C 1 min. y 72º C 1 min, con extensión final a 72 º C 5 min. El producto de PCR se purificó y concentró por diálisis de centrifugación. Se comprobaron los resultados de amplificación y purificación cargan- do 1 µl de producto en gel de agarosa al 1,5 %. El fragmento se secuenció directamente a partir de producto de PCR purificado utilizando un secuenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystems, Warrington, UK) y las secuencias fue- ron revisadas a mano. Para la región control se usaron el primer ND6F (3’ATTTGATG- CAACCGCTAACC 5’), diseñado específicamente para el extremo 5’ de esta especie y el H505 (BURG & CROXALL 2001) que amplifican unos



300 pb en la primera región hipervariable (HV1).

Análisis filogenéticos y poblacionales


Una vez limpias y corregidas las secuencias, estas se alinearon mediante el programa CHRO- MASPRO hasta obtener un alineamiento sin ambigüedades para cada fragmento. Se utilizó el programa MODELTEST v 3.06 (POSADA & CRANDALL 1998) para seleccionar el modelo de sustitución que mejor se adaptaba a nuestros datos. En nuestro caso, el modelo evolutivo seleccionado para las dos regiones mitocondria- les analizadas fue el modelo HKY85 (HASEGA- WA et al. 1985). Las relaciones filogenéticas entre haplotipos se analizaron mediante aproximacio- nes de Mínima Evolución (ME) usando PAUP

4.0b10 (SWOFFORD 2003) y asumiendo el modelo evolutivo seleccionado. La robustez de los nodos se testó mediante análisis de bootstrap (FELSENSTEIN 1985) y Quartet Puzzling, res- pectivamente (STRIMMER et al. 1996).


Se utilizaron el número de secuencias diferentes

(número de haplotipos), la diversidad génica

(heterozigosidad esperada) y diversidad nucleo- tídica (número promedio de ‘pairwise differen- ces’ por posición) para describir la variabilidad genética dentro y entre poblaciones. Todos estos índices se calcularon con el programa ARLE- QUIN (v.2.0.1.1.) (SCHNEIDER et al. 2000). Algunos individuos presentaron indicios de heteroplasmia mitocondrial y fueron descarta- dos. Para estimar el grado de conectividad entre poblaciones y su posible variación a lo largo del tiempo se agruparon las colonias más cercanas en cuatro grupos pertenecientes a las 4 unidades geográficas mas importantes (Mallorc a, Cabrera, Menorca, y Pitiüsses, esta ultima correspondiendo a Eivissa y Formentera) que fueron utilizados como unidad de análisis.


Calculamos los estadísticos Fst y una AMOVA global (Análisis de Varianza Molecular, EXCOF- FIER et al. 1992) con el programa Arlequin y con las distancias de secuencias corre gidas. Efectuamos dos diseños de AMOVA: a) inclu- yendo todos los individuos; b) excluyendo los individuos de Menorca, donde la evidencia de hibridación es mayor.
Los patrones de migración y relaciones genéti- cas entre gr upos se analizaron utilizando MIGRATE (BEERLI & FELSENSTEIN 1999,

2001) que por teoría de coalescencia estima las tasas de migración entre dos poblaciones. Este método usa toda la información de los datos y ofrece estimas fiables de divergencia genética, especialmente cuando las tasas de migración son elevadas, (y los valores de Fst consecuente- mente bajos). Cada MCMC consistió en 10 cade- nas cortas (muestreo de 10.000 árboles) y dos cadenas largas (muestreo de 5,000.000 árboles) con un periodo de burn-in de 10.000 árboles. La robustez de los estimadores se validó comparan- do re sultados entre diferentes cadenas de Markov (ver BEERLI & FELSENSTEIN 1999,



2001). Con este método obtuvimos estimadores, del parámetro de migración M (tasa de migra- ción escalada por la tasa de mutación) entre cada par de grupos y en las dos direcciones posi- bles de flujo. Para tener información adicional, estimamos la emigración e inmigración total para cada isla utilizando tanto el valor estimado de M como las puntuaciones relativas.



La desviación de la variabilidad esperada bajo condiciones de neutralidad y estabilidad demo- gráfica se testó mediante los estadísticos D de TAJIMA (1989) y Fs de FU (1997), con el uso del programa ARLEQUIN (v.2.0.1.1.). El estadístico Fs es particularmente sensible al crecimiento poblacional. Valores negativos de ambos esta- dísticos indican un proceso una expansión poblacional. Una posible expansión poblacional fue analizada por la distribución de “mismatch” entre pares de haplotipos usando Arlequin y representada gráficamente con DNASP (ROZAS et al. 2003). La distribución de mismatch tiende a ser multimodal en poblaciones en equilibrio demográfico y unimodal en aquellas que han experimentado una expansión demográfica (ROGERS & HARPENDING 1992). La compara- ción estadística de la distribución de mismatch se basó en la aproximación de SCHNEIDER & EXCOFFIER (1999), donde se compara la distri- bución observada con la esperada bajo un modelo nulo de expansión poblacional. En caso de no rechazarse la hipótesis nula, los paráme- tros de la expansión (edad y tamaño poblacional antes y después del evento) se han estimado asumiendo una tasa de evolución de 0.9% /MY para el cit-b basada en calibración fósil in Procellaridae de tamaño medio (NUNN & STANLEY, 1998), y un tiempo de generación de

11 años calculado para la especie (ORO et al.

2004). Finalmente, el patrón filogeográfico se

investigó mediante un análisis de clados anilla-

dos (NCPA) (TEMPLETON 1998). Este análisis

testa asociación geográfica entre haplotipos y

sugiere posibles interpretaciones en el caso de

haber asociaciones. Aunque ha recibido algunas

críticas (KNOWLES & MADDISON 2002, aun-

que ver TEMPLETON 2004), el NCPA propor-

ciona un marco empírico muy útil para diluci-

dar entre los procesos ecológicos e históricos

determinantes de la estructura genética. Para

ello se partió de una red de haplotipos de parsi-

monia utilizando el programa TCS (CLEMENT

et al. 2000) para estimar los agrupamientos

haplotípicos y visualizar el numero de mutacio-

nes entre ellos. Mediante el programa GEODIS

(POSADA et al. 2000) se calcularon los estadísti-
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