Salmonella spp



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RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA

FECHA DE PUBLICACIÓN:

JULIO 2016

PROTOCOLO E INFORME ARMONIZADO PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DEL MÉTODO DE REFERENCIA PARA EL AISLAMIENTO DE SALMONELLA SPP. APÉNDICE A NORMATIVO, NOM-210-SSA1-2014

FECHA DE EJECUCIÓN:

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PROTOCOLO ARMONIZADO PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DEL MÉTODO DE REFERENCIA PARA EL AISLAMIENTO DE

Salmonella spp.

APÉNDICE A NORMATIVO, NOM-210-SSA1-2014

Participaron en la elaboración de este protocolo.

Vanessa Pérez García

Laboratorio de Análisis de Riesgos del Distrito Federal

Responsable del área de Análisis Microbiológico II

vperez@sersalud.df.gob.mx

50381700 ext. 6873



María Esperanza Rodríguez Parra

Laboratorio Estatal Salud Pública Tamaulipas

Responsable de Laboratorio de Microbiología de Aguas y Alimentos



lespt@hotmail.com

834 312 6633



Liliana Areli Cano Ramirez

Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.

Coordinadora de Microbiología Sanitaria



lacano@cofepris.gob.mx

50805200 ext 2045





Participaron en la revisión de este protocolo.

Odilia Hernández Hernández

Laboratorio Estatal de Salud Pública de Veracruz

Jefe de Departamento de Análisis Sanitarios



  1. 9811390 Ext.117

lesp.ohernandez@gmail.com

Juan Carlos Piliado Velasco

Laboratorio de Análisis de Riesgo del Distrito Federal

Jefe de Laboratorio de Análisis de Riesgo del Distrito Federal



lar_df@live.com.mx

50381700 ext. 6873



César Omar Gálvez González

Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura

Coordinador de Proyectos Analiticos.

Teléfono 50805200 ext. 2022

cgalvez@cofepris.gob.mx


I.Q. Félix Pineda Salgado

Laboratorio Estatal de Salud Pública de Morelos

jcaslespmor@gmail.com

Anastacio Palacios Marmolejo

LESP- Aguascalientes

Jefe de Departamento de C. Microbiológico

449 9775511

anastaciopalacios73@gmail.com


Karina Guerrero Colina

Laboratorio Estatal de Salud Pública de Veracruz

Jefe de Departamento de Análisis Sanitarios

(229) 9811390 Ext.117

lesp.ohernandez@gmail.com


Josué Tena Ramos

Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura



Gerente de Análisis y Desarrollo de Pruebas Microbiológicas.

50805200 ext. 2007

jtena@cofepris.gob.mx



Autorización

Imelda Rocio Guzman

Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.



Directora Ejecutiva de Control Analítico.

01 55 50 80 52 00 ext. 2043

jgutierrez@cofepris.gob.mx


Josefina Gutiérrez Ramírez

Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.



Directora Ejecutiva de Innovación.

01 55 50 80 52 00 ext. 2005

jgutierrez@cofepris.gob.mx




  1. OBJETIVO.

Establecer las directrices para la evaluación del desempeño del Apéndice A Normativo. Método de referencia para el aislamiento de Salmonella spp, NOM-210-SSA1-2014 en las matrices de alimentos de su interés y competencia, mediante la aplicación de este protocolo armonizado, a través de la verificación del límite de detección y selectividad.

  1. CAMPO DE APLICACIÓN.

Este protocolo es de aplicación a la Red Nacional de Laboratorios en el proceso de implementación del Apéndice A Normativo. Método de referencia para el aislamiento de Salmonella spp. en productos para consumo humano.

  1. DIAGRAMA DE FLUJO

El diagrama de flujo es una representación gráfica del método, en todo momento se debe tener acceso al método de prueba original.



  1. EQUIPOS E INSTRUMENTOS

Los equipos listados a continuación son los requeridos por el método de prueba. En el informe de evaluación de desempeño deberá completarse la “Tabla equipos e instrumentos empleados” solo con los equipos criticos.

Nombre

Características

Estado

Balanza Granataria

Sensibilidad de 0.1 g

Calibración vigente y verificado el día de uso.

Marco de pesas

Clase F2 o M1

10 ó 20 g;

y 100 g ó 200 g ó 500 g


Calibrado

Incubadora

Temperatura controlada a 36°C ± 1°C.

Calificada1 a 36 ± 1°C, por 24 h mínimo. Con termómetro2 calibrado o verificado para realizar la lectura de la temperatura de la cámara por lo menos dos veces al día. División mínima de 0.5°C adecuadamente inmerso.

Cuenta colonias

Funcionando, lámpara con iluminación.

Mantenimiento vigente lámpara funcionando y lupa limpia sin rayaduras ni roturas.

Homogeneizador Peristáltico o Licuadora3

Funcionando.

Mantenimiento vigente.

Licuadora no debe presentar fugas en el momento de la operación, los vasos deben ser esterilizables.



Baño de agua o Incubadora.

Temperatura controlada a 41.5°C ± 1°C.

Calificado a 41.5 °C +/- 1°C.

Con termómetro calibrado ó verificado4 para realizar la lectura de la temperatura, por lo menos dos veces al día. División mínima de 0.5°C adecuadamente inmerso.



Baño de agua

Temperatura controlada a 36°C ± 1°C.

Calificado a 36 °C +/- 1°C.

Con termómetro de inmersión parcial calibrado ó verificado para realizar la lectura de la temperatura, por lo menos dos veces al día. División mínima de 0.5°C adecuadamente inmerso.





  1. MATERIALES

El material para trabajo debe ser estéril, cuando no se indique otra cosa el material esterilizado por calor seco o calor húmedo se considera estéril hasta un mes después de esterilización siempre que se mantenga la integridad del empaque, por lo que todo el material debe ser adecuadamente identificado, señalando la fecha de esterilización de material y la fecha de uso. Cuando se use material estéril desechable, este deberá ser evaluado por lote en su recepción o documentarse mediante certificado de calidad, una vez abierto el empaque los materiales no deben ser usados después de tres días.

El material de vidrio reutilizado deberá demostrar que fue lavado adecuadamente mediante registros de supervisión, y demostrar la ausencia de residuos de detergente.



Los siguientes materiales son de carácter enunciativo, el laboratorio deberá reportar los utilizados y sus características en el informe.

  • Asas platino, de níquel o desechables de 3 mm o 10 µL

  • Cucharas, cuchillos

  • Tubos de cultivo de 16 mm x 150 mm o frascos de 125 a 250 mL de capacidad.

  • Tubos de cultivo de 10 mm x 75mm.

  • Cajas Petri de 90 a 100 mm de diámetro.

  • Pipetas de 10mL, 5 mL y 1mL con divisiones de 0.5mL y 0.1mL respectivamente.

  • Mecheros Bunsen o Fisher

  • Papel indicador pH con resolución de 0.2 unidades.



  1. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

    1. Medios de cultivo.

      1. Agua Peptonada amortiguada.

      2. RVS.

      3. MKTTn.

      4. XLD.

      5. ASB.

      6. Medio selectivo o cromogénico5

      7. Agar nutritivo.

      8. TSI

      9. LIA

      10. Agar Urea de Christensen

      11. Medio L-Lisina descarboxilasa

      12. Caldo triptona al 1%

      13. Solución salina fisiológica.



    1. Reactivos.

      1. Antisuero somático (O) polivalente de Salmonella.

      2. Solución yodo-yoduro

      3. Alfa naftol

      4. KOH

      5. Reactivos de Kovac o Erlich

      6. Tolueno

      7. Solución de creatina.

      8. Novobiocina (sal sódica)

      9. Agente de detección de la beta-galactosidasa.

      10. ONPG6

      11. NaOH 1N

      12. RM-VP

      13. Dependiendo de la matriz seleccionada, puede ser necesario otros reactivos o materiales no indicado en esta lista y utilizados en la preparación de la muestra.



    1. Cepas Control

      1. Microorganismos Blanco

        1. Como Microorganismo de interes es recomendable utilizar una cepa con las siguientes características:

          • Aislada frecuentemente de la matriz en la que se está haciendo la validación.

          • Preservada adecuadamente.

          • Identificada hasta serotipo.



        1. Cuando no se cuente con una cepa nativa se usará Salmonella Typhimurium ATCC 14028 (S.Typhimurium);



      1. Microorganismo interferente

        1. Como microorganismo interferente es recomendable utilizar una cepa que aislada como sospechosa mediante un método autorizado de Salmonella spp, no sea confirmada como Salmonella (bioquímicamente/serológicamente). Cuando no se cuente con esta cepa, se puede utilizar Citrobacter freundii ATCC 8090.



      1. Preparación del inóculo

        1. El protocolo de preparación del inóculo puede ser elegido a conveniencia del laboratorio, pero debe asegurar que se alcanzan los tamaños de inóculos deseados, este debe describirse en el informe.

        2. Realizar diluciones seriadas con un factor de dilución de 10, partiendo de una suspensión de cepa con concentración inicial desconocida.

        3. Calcular el volumen del inóculo de las dos cepas control con respecto a la cuenta obtenida, dependiendo de la prueba:

          • Para la verificación del límite de detección se requiere un inóculo de < 10 UFC del Microorganismo de interes en cada porción de 25 g ó 25 mL de muestra.

          • Para la selectividad se requiere > 100 UFC del microorganismo interferente y < 10 UFC del Microorganismo de interes por cada porción de 25 g o 25 mL de muestra.



        1. Para la preparación del inóculo pueden consultarse el documento “Criterios para la Evaluación del Desempeño de Métodos de Prueba Microbiológicos para el Análisis de Alimentos. CCAYAC-CR-18/2.



  1. MUESTRAS

    1. Cada laboratorio deberá realizar la evaluación del desempeño del método con al menos una matriz por cada grupo de alimentos indicado en la siguiente tabla

    2. En el informe de validación se deberá reportar los criterios para la selección de la muestra considerando los mencionados a continuación:



Grupo de alimentos

Tipos de producto

Tipo de producto recibido en el laboratorio

Matriz representativa mayormente recibida en el laboratorio

Prioridad para el laboratorio.7 [1]



Productos Cárnicos

Crudo

Procesados térmicamente

Congelados

Fermentados

Curado

Pate


Reportar en el informe

Reportar en el informe

Reportar en el informe

Pescado y Productos de la pesca

Crudos

Congelados



Reportar en el informe

Reportar en el informe

Reportar en el informe

Frutas y Vegetales

Crudos

Reportar en el informe

Reportar en el informe

Reportar en el informe

Leche y lácteos

Crudos

Congelados

fermentados

Queso artesanal



Reportar en el informe

Reportar en el informe

Reportar en el informe

Otros Productos

Para ser llenado por cada laboratorio

Reportar en el informe

Reportar en el informe

Reportar en el informe




    1. La selección de las muestras debe realizarse con base en las prioridades del laboratorio, la frecuencia de recepción y los programas prioritarios. Se deberá contar con aproximadamente 1.5 kg de muestra y almacenar en condiciones adecuadas dependiendo la matriz, reportar cuando sea posible la información necesaria para la trazabilidad de la misma por ejemplo nombre, marca, presentación, lote y fecha de caducidad de dichos productos.



    1. Verificación de la muestra:

      1. Las muestras seleccionadas deberán ser analizadas para la búsqueda de Salmonella spp. utilizando el método en cuestión.

      2. Deberá realizarse por triplicado, encontrando resultados negativos en las tres repeticiones.




  1. DESARROLLO EXPERIMENTAL

    1. Verificación del tamaño del inóculo. El día de la realización de las pruebas inocular por duplicado cajas Petri por lo menos 6 veces el volumen del inóculo que se utilizara en la validación, adicionar de 18 a 20 mL de un agar nutritivo como Agar Cuenta Estándar o AST, fundido y a 44°C-46°C, agitar suavemente para homogeneizar el inóculo, evitar que el medio salpique la tapa de la caja, incubar a 35°C ± 2°C por 24 h ± 2h. Después del periodo de incubación contar las colonias y registrar en el formato correspondiente.



    1. Preparación de la muestra de ensayo. Tomar diferentes porciones del alimento, transferir 25 g o 25 mL a frascos o bolsas conteniendo 225 mL de diluyente, dependiendo de la naturaleza de la muestra, adicionar el volumen del inóculo del ó los microorganismos de interés en función del parámetro a evaluar según se indica en los puntos siguientes




    1. Verificación del límite de detección. A la muestra preparada inocular < 10 UFC del Microorganismo de interes, homogeneizar de forma adecuada dependiendo de la naturaleza de la muestra. Aplicar el método de prueba correspondiente, realizando 10 repeticiones por al menos dos analistas ó por un analista en tiempos diferentes. (ver tabla 1)



    1. Selectividad: A la muestra preparada, inocular >100 UFC del microorganismo interferente y <10 UFC del Microorganismo de interes Aplicar el método de prueba correspondiente. Continuar con el método de prueba, realizando 10 repeticiones por al menos dos analistas ó por un analista en tiempos diferentes.

    2. Identificación de los aislamientos: Para el alcance de este protocolo, puede ser suficiente confirmar bioquímicamente al menos una cepa por repetición.

Tabla 1 Preparación de las pruebas

Parámetro

Analistas

Muestra

No. de réplicas

Microorganismo

Tamaño del inóculo

Valor Esperado

Verificación de la muestra

Al menos un analista

25 g

3

Sin inóculo

Sin inóculo

Ausencia de Salmonella spp

100%

Verificación de límite de detección

Al menos dos analistas, o dos tiempos diferentes

25 g

10 por analista o por tiempo

Microorganismo de interes

< 10 UFC

Presencia de Salmonella spp

80%

Selectividad

Al menos dos analistas, o dos tiempos diferentes

25 g

10 por analista o por tiempo

Microorganismo Interferente
Microorganismo de interés

> 100 UFC

< 10 UFC

Presencia de Salmonella spp

80%



  1. RESULTADOS

Registrar los resultados obtenidos en el Informe.

  1. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

    1. Verificación del tamaño del inóculo. Calcular el promedio del recuento las placas y posteriormente calcular el promedio de las 6 repeticiones8. La verificación del inóculo debe realizarla cada analista.

    2. Verificación del límite de detección. Determinar este parámetro a través de la siguiente fórmula:

LD=

Dónde:


LD: Límite de detección

p: Número de muestras con resultados positivos a Salmonella spp.

n: Número total de repeticiones realizadas por analista.

Interpretación: % de resultados positivos al nivel de UFC evaluado ( < 10 UFC) en 25 g. de muestra.



    1. Selectividad.

      1. Determinar este parámetro a través de la siguiente fórmula:

S =

Dónde


p: Número de muestras con resultados positivos a Salmonella spp.

n: Número total de repeticiones realizadas por analista.

Interpretación: % de resultados positivos al nivel de UFC ( < 10 UFC) del Microorganismo de interés con una concentración de microorganismo interferente > 100 UFC.



    1. Incertidumbre.

      1. Es un parámetro asociado al resultado de medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos al mensurando. Al ser un método cualitativo, se debe mencionar las fuentes de incertidumbre dentro del método.



  1. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

Parámetro de desempeño

Criterio

Verificación del tamaño del inóculo

Al verificar el tamaño del inóculo por lo menos seis veces en promedio se obtienen cuentas de menos de 10 UFC y ninguna repetición de mas de 10UFC

Verificación de la muestra

Muestras no contaminadas

No. de repeticiones = 3 por analista

No. de analistas = 1

Resultados positivos = 0%



Verificación del límite de detección

No. de repeticiones = 10

No. de analistas = 2

Resultados positivos = al menos el 80%

Tamaño del inóculo = menos de 10 UFC



Selectividad

No. de repeticiones = 10

No. de analistas = 2

Resultados positivos = 80%

Tamaño del inóculo = 100 UFC del microorganismo interferente y menos de 10 UFC del Microorganismo de interés.





  1. REFERENCIAS

    1. NOM-210-SSA1-2014. Productos y Servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos. Apéndice A, Método de Referencia para el aislamiento de Salmonella spp.

    2. CCAYAC-CR-18/2. Criterios para la Evaluación del Desempeño de Métodos de Prueba Microbiológicos para el Análisis de Alimentos.

    3. CCAYAC-CR-18/3 Criterios para la Evaluación del Desempeño de Métodos de Prueba Microbiológicos para el Análisis de Alimentos. Borrador.

INFORME ARMONIZADO PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DEL MÉTODO DE REFERENCIA PARA EL AISLAMIENTO DE

Salmonella spp.

APÉNDICE A NORMATIVO, NOM-210-SSA1-2014

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