Sensibilidad o linealidad fotométrica



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SENSIBILIDAD O LINEALIDAD FOTOMÉTRICA

Es la capacidad de respuesta lineal de un espectrofotómetro a concentraciones crecientes o decrecientes de una sustancia que cumpla la Ley de Beer a distintas longitudes de onda.


La Ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia (A) de una sustancia en solución es directamente proporcional a la concentración (C) de dicha solución y dicha proporcionalidad está dada por el coeficiente de absorción molar () de la sustancia y por el camino óptico (b) que recorre la luz al atravesar la solución :
A =  . b. C
La capacidad de un espectrofotómetro de dar respuestas lineales a cambios crecientes o decrecientes en la concentración de una sustancia que cumple la Ley de Lambert – Beer se denomina LINEALIDAD FOTOMÉTRICA. Esta propiedad permitre conocer el rango de absorbancias dentro del cual un espectrofotómetro produce respuestas proporcionales a los cambios de concentración de una sustancia.

Una de las causas importantes que pueden originar pérdida de linealidad fotométrica, es la presencia de LUZ PARASITA.

El propósito es correlacionar el estudio de linealidad fotométrica con la presencia de luz parásita y establecer el grado de influencia de ésta en los casos en que se detecte pérdida de linealidad.

CONTROL DE LA LINEALIDAD FOTOMÉTRICA


El método mas práctico consiste en preparar diluciones de determinadas sustancias y ver la respuesta del instrumento. Se recomienda medir la linealidad a más de una longitud de onda, sobre todo de aquellas sustancias utilizadas en los métodos de detección de Química Clínica.

Para el control se usan soluciones de concentraciones crecientes :



  1. dicromato de potasio ácido a 340 nm

  2. p – nitrofenol a 405 nm

  3. nitrato de cobalto a 510 nm

  4. cianmetahemoglobina 540 nm

a) b)





c) d)









  1. recta ideal

  2. buena linealidad. Diferencia de exactitud de la absorbancia

  3. linealidad aceptable hasta aproximadamente 1000 UA, luego disminuye

  4. mala linealidad en todo el rango de absorbancia ( mala sensibilidad : no registra cambios significativos de absorbancia al cambiar la concentración )

VALORES ÓPTIMOS : error pendiente menor o igual al 2 %


VALORES ACEPTABLES : error pendiente menor o igual al 3 %

LECTURA DE LAS 4 SOLUCIONES DE DICROMATO DE POTASIO (A,B,C,D)


    • Tener encendido el equipo el tiempo que indique el fabricante antes de realizar la experiencia.

    • Elegir una cubeta limpia y sin rayaduras y ajustar el cero de absorbancia con agua destilada a la longitud de onda de trabajo (340, 350 o 366 nm). Si no puede llevar a cero de absorbancia a dicha longitud de onda, eso es índice de mal funcionamiento del espectrofotómetro por lo que recomendamos llamar al servicio técnico de su instrumento para solucionar el problema.

    • Medir la absorbancia de la solución A y registrar el resultado. Volcar la solución, volver a cargar la solución A, medirla y registrar el resultado. Calcular la absorbancia promedio de las dos medidas.

    • Proceder con las soluciones B, C y D de la misma forma que se realizó con A, realizando las lecturas por duplicado y calculando las absorbancias promedio.


LECTURA DE LAS 4 SOLUCIONES DE P-NITROFENOL A 405 nm



Espectrofotómetros manuales :


    • Tener encendido el equipo el tiempo que indique el fabricante antes de realizar la experiencia.

    • Llevar el selector de longitud de onda a 405 nm y seleccionar la temperatura de trabajo (25, 30 o 37 °C)

    • Elegir una cubeta limpia y sin rayaduras y ajustar el cero de absorbancia con agua destilada.

    • Medir la absorbancia de la solución C1 y registrar el resultado. Volcar la solución, volver a cargar la solución C1, medirla y registrar el resultado. Calcular la absorbancia promedio de las dos medidas.

    • Proceder con las soluciones C2, C3 y C4 de la misma forma que se realizó con la solución C1.


Espectrofotómetros con bomba de aspiración :
Para los puntos 1 y 2 realizar las medidas por duplicado de la siguiente manera :

    • Seleccionar la temperatura de trabajo (25, 30 o 37 °C)

    • Llevar a cero de absorbancia a 405 nm con agua destilada. Aspirar aire.

    • Aspirar la solución a medir y registrar el valor. Aspirar aire y repetir la operación con la misma solución. Calcular la absorbancia promedio y registrarla en la planilla de resultados correspondientes.

    • Aspirar aire y pasar a medir la siguiente solución.


Autoanalizadores y equipos automáticos :
Consultar el manual del fabricante para seleccionar la función o test que permita medir absorbancias absolutas. Seleccionar la temperatura de trabajo (25, 30 o 37°C). Seleccionar la longitud de onda de 405 nm. Realizar un blanco con agua destilada y proceder a la medición de las absorbancias de todas las soluciones por duplicado.

En caso que el camino óptico de la celda de medición no sea de 1 cm, realizar la corrección que corresponda para normalizar la absorbancia a 1 cm de paso de luz. El factor a utilizar en dichos casos será :

1 cm

Abs. Normalizada = Abs. leída x ------------------------------------------------



Camino óptico de la celda en cm
Si tiene alguna duda de cómo realizar estas mediciones con cu equipo automático, le aconsejamos se comunique con el servicio técnico de su fabricante.

LUZ PARASITA
Es toda radiación electromangnética de longitud de onda distinta a la seleccionada por el monocramador que alcanza el detector y por lo tanto queda registrada por el instrumento. O sea, es la radiación que alcanza el detector sin haber pasato a través de la muestra.

CONTROL DE LUZ PARASITA

Se puede medir introduciendo en el aparato una muestra que tenga una transmitancia del 0 %, por lo tanto, cualquier radiación detectada e indicada en el lector corresponderá a luz espuria.


Ajustar cuidadosamente el 100 % T con agua destilada a 340 nm. Luego medir la transmitancia aparente de una solución de NO2Na (50g/l). El valor máximo admisible o aceptable de T es de 1.0 % y el valor óptimo de T es menor o igual al 0,5 %.
Una de las causas importantes que pueden originar pérdida de linealidad fotométrica es la presencia de luz parásita. Esta puede estar originada en filtraciones o “goteras” en el compartimento de medida que permiten que la radiación del exterior llegue al detector, como así también por dispersión de la luz incidente por suciedad o imperfecciones en las superficies de las piezas del circuito óptico. Entonces la presencia luz parásita produce un aumento de transmitancia y disminución de absorbancia, esto adquiere más peso en absorbancias altas, por lo que se traduce en una pérdida de la linealidad a medida que aumenta la absorbancia.
Lectura de la solución de nitrito de sodio (solución control “luz parásita”)


  • llevar a cero de absorbancia con agua destilada a 340 nm.

  • si el espectrofotómetro permite hacer mediciones de transmitancia, colocar el selector de modo transmitancia y medir el % de T de la solución control. Realizar la experiencia por duplicado y registrar el valor promedio en la casilla indicada como % T.

  • Si el espectrofotómetro no permite hacer mediciones de transmitancia, medir la absorbancia de la solución. Realizar la medición por duplicado y registrar el valor promedio en la casilla indicada como “Abs”. En el caso que la absorbancia supere la capacidad de lectura del instrumento, consultar el manual del fabricante para saber cual es la máxima absorbancia que puede detectar el equipo e indicar el resultado como : “mayor que dicho valor”. Por ejemplo hay instrumentos que no pueden leer absorbancias mayores de 2.000 UA. Si la lectura de esta solución supera dicho valor, informar como “mayor de 2.000”.

Nota 1 : Espectrofotómetros con bomba de aspiración




  • llevar a cero de absorbancia con agua destilada a 340 nm

  • aspirar aire

  • aspirar la solución control y registrar el valor. Aispirar aire y repetir la operación con la misma solución. Calcular la absorbancia promedio y registrarla en la pantalla de resultados correspondiente.

Nota 2 : Autoanalizadores y equipos automáticos


Consultar el manual del fabricante para seleccionar la función que le permite medir absorbancias absolutas. Seleccionar la longitud de onda de 340 nm. Realizar un blanco con agua destilada y medir las absorbancias de la solución por duplicado.

En caso caso que el camino óptico de la celda de medición no sea de 1 cm realizar la corrección que corresponda para normalizar la absorbancia a 1 cm de paso de luz. El factor a utilizar en dichos casos será :


1 cm

Abs normalizada = Abs leída x ----------------------------------------------------


Camino óptico de la celda (en cm)


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