Tp n° 13 – hemostasia secundaria obtención de muestras indicaciones para el paciente



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TP N° 13 – HEMOSTASIA SECUNDARIA
OBTENCIÓN DE MUESTRAS
INDICACIONES PARA EL PACIENTE: para realizar los estudios de coagulación no es necesario un ayuno prolongado, pero es conveniente no ingerir alimentos grasos desde 4h antes de la extracción .Debe tratar de evitarse situaciones de estrés o esfuerzo físico durante horas previas a la toma de muestra ya que se producen variaciones importantes

La extracción de sangre debe realizarse por la mañana (entre las 8 y las 10) y con el mínimo éstasis venoso posible (idealmente menos de 1 minuto y sin lazo, esto último raramente se efectúa).

La noche anterior del estudio el paciente no debe realizar actividad física ni comer en forma abundante debe recurrir al laboratorio realizando la menor actividad posible y en conocimiento que al llegar debe permanecer en reposo por lo menos 30min antes de la extracción.
ANTICOAGULANTE: El anticoagulante mas ampliamente utilizado es el citrato trisódico en cc. 0,109 o 0,129 M (3.2 o 3.8%) el comité de expertos de la Sociedad internacional de Hemostasia y Trombosis (ISHT) recomienda el citrato al 3.2% .Los plasmas patrones liofilizados con los cuales se calcula el índice de sensibilidad internacional (ISI) se obtienen con citrato trisódico 3.2%.

Se debe mantener la relación anticoagulante /sangre 1+9 hay que tener presente que se deberá ajustar la relación de acuerdo al hematocrito sobre todo los por debajo de 25% y por arriba de 55%.


EXTRACCIÓN: Para realizar la extracción sanguínea se debe utilizar jeringas plásticas de buena calidad. Las agujas descartarles de calibre entre 21 y 19 para adultos y 23 G para pediatría. Los tubos para recoger la sangre deben ser de material no reactivo como polipropileno o vidrio siliconado.

No se aconseja utilizar sangre capilar para pruebas de coagulación, si no es posible obtener una muestra de sangre venosa, la muestra puede ser obtenida del pulpejo del dedo en los adultos o del talón del pie en los neonatos. Es esencial que la punción realizada permita que la sangre fluya espontáneamente y forme una gota de volumen importante, la cual se deberá recoger en tubos con la proporción de anticoagulante ajustada.

La punción venosa debe ser rápida y precisa, sin dificultades, evitando la formación de espuma, el éstasis venoso y la contaminación con tromboplastina tisular

Cuando la extracción es dificultosa se recomienda el cambio de jeringa luego de extraer 2 a 3 ml de sangre. La muestra extraída en la segunda jeringa será utilizada para los estudios de coagulación.

En los pacientes canalizados se recomienda evitar la extracción por catéter, de ser ello indispensable, realizar la doble extracción con jeringa y descartar los primeros 5 mL. Los pacientes canalizados, en ocasiones puede recibir heparina, para mantener la permeabilidad del catéter y en el laboratorio de hemostasia la heparina es “mala palabra” prolonga todas las pruebas.

Una vez realizada la extracción se vierte suavemente la sangre por la pared de los tubos, hasta la marca prevista, evitando la formación de espuma

Todo el material utilizado en hemostasia es de plástico, para evitar que el vidrio active la cascada de la coagulación.

Es conveniente recoger la sangre en dos tubos, pues al tener la posibilidad de procesar en un segundo tubo se reducirán las posibilidades de error.

Descartar los plasmas con signos de hemólisis visibles.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA

Plasma citratado rico en plaquetas (prp): la sangre obtenida de acuerdo a las condiciones ya señaladas es centrifugada a 1000 r.p.m durante 5 minutos. Trasvasar el plasma rico a un tubo de plástico con pipeta plástica. Mantener a Tº ambiente hasta su uso (no mas de 2h). El plasma así obtenido es el plasma rico en plaquetas.

Se utiliza fundamentalmente para el estudio de la función plaquetaria y para el tiempo de plasma recalcificado (Tiempo de Howell)


Plasma citratado: Se obtiene centrifugando la sangre durante al menos 10 min. a 3000 r.p.m. El plasma así obtenido es relativamente “pobre en plaquetas” (menor de 10000/mm3). Se utiliza dentro de las 4 h de extracción para los estudios pre- quirúrgicos, control de anticoagulación en los pacientes sin antecedentes de sangrado o trombosis.
Plasma pobre en plaquetas: Se obtiene por doble centrifugación (primero de sangre entera y luego el plasma citratado y separado) de 15 minutos a 4000 rpm (idealmente en centrífuga refrigerada a 4°C). El plasma así obtenido es “pobre en plaquetas” (menor de 5000/mm3) reúne las condiciones para realizar todos los estudios. Puede ser fraccionado y congelado para estudios posteriores. En este caso se aconseja procesar de igual forma muestras normales.
Pool de plasmas normales: Se debe extraer sangre de sujetos normales, sin historia previa de manifestaciones hemorrágicas, ni trombóticas, ni hepáticas, que no estén recibiendo ninguna medicación. Se prepara plasma pobre en plaquetas de por lo menos 10 sujetos que tengan las pruebas básicas de coagulación normal. Se puede fraccionar y congelar a-70ºC máximo 6 meses y 1 mes si se conserva a -20ºC

Activación intrínseca de la protrombina
TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADO (APTT)
Fundamento

El APTT, es la prueba más sensible para evaluar la vía intrínseca de la coagulación. Consiste en activar el plasma por contacto con superficies cargadas negativamente (caolín, sílica, etc.). En esta prueba se fija la concentración de fosfolípidos presentes en la reacción, mediante el agregado de cefalina (tromboplastina parcial). La activación por contacto se ve favorecida por el agregado de caolín (sustancia inerte, con cargas negativas) que aumenta la superficie de contacto.


Expresión de resultados

Los resultados se expresan en segundos.


Interpretación de resultados

Valor normal: según el reactivo utilizado y el método de detección: 37-48 seg.

Valores menores a 37 seg indican concentración aumentada de factores o muestra activada. Valores prolongados revelan un defecto en la vía intrínseca.

El APTT es más sensible al defecto de los factores VIII, IX, XI, XII o fase de contacto como precalicreína (PK), quininógenos de alto peso molecular (HMWK). Es menos sensible al defecto de factores de la vía común (X, V o II). En casos de deficiencias de fibrinógeno, el APTT se prolonga a partir de concentraciones menores a 100 mg/dL.

Presencia de inhibidores, ya sean específicos contra un factor (neutralizantes) o inespecíficos (interferencia) afectan la prueba del APTT (dependiendo de la sensibilidad del reactivo), que no corrige por el agregado de plasma normal. La heparina no fraccionada (UFH), que potencia la acción inhibitoria de la antitrombina frente a la trombina, puede afectar el resultado del APTT.
FACTORES DE VIA INTRINSECA (VIII, IX, XI, XII, PK, HMWK)
Fundamento

Este método mide la formación de fibrina por acción de la trombina generada en un sistema coagulante que aporta todos los factores excepto el factor en estudio. El tiempo de coagulación del sistema es dependiente de la concentración del factor presente en la muestra problema.


Expresión de resultados

Los resultados se expresan en por ciento de actividad.

Para la construcción de la curva de calibración, en papel doble logarítmico, se transportan las concentraciones de factor (%) sobre la abscisa y los tiempos de coagulación (seg) sobre la ordenada. Se interpola la concentración del factor en el plasma problema en la curva obtenida.
Interpretación de resultados

Valores normales: 50-150 %

El descenso de los niveles plasmáticos de cualquiera de estos factores puede deberse a un déficit congénito (cuali o cuantitativo), adquirido, o a la presencia de inhibidores.

Activación extrínseca de la protrombina

TIEMPO DE QUICK O TIEMPO DE PROTROMBINA
Fundamento

Se utiliza como reactivo tromboplastina cálcica (comercial) que, en contacto con el plasma citratado, genera la activación del mecanismo extrínseco y la producción de fibrina. El tiempo de coagulación de la prueba depende de la concentración de los factores plasmáticos que participan en el mecanismo extrínseco de la coagulación.


Expresión de resultados

Los resultados se expresan en por ciento de actividad y/o tiempo en segundos. Se realiza el tiempo de protrombina y se interpola el tiempo en la curva de Quick o curva de tasa de protrombina.


Interpretación de resultados

Valor normal: 70-100%

Resultados de tiempo de protrombina menores a 70% evidencian una anormalidad del mecanismo extrínseco debida a un defecto o a la inhibición de uno o más de los factores intervinientes en la vía extrínseca. Se deberá corregir la prueba con plasma normal para descartar un efecto inhibitorio y realizar la determinación individual de cada uno de los factores para identificar el o los factores deficientes.

El general, tiempo de Quick es más sensible al defecto de los factores VII, X y V que a la deficiencia de protrombina. No detecta disminuciones moderadas de fibrinógeno, pero se ve afectado por concentraciones menores a 100 mg/dL.


FACTORES DE VIA EXTRINSECA (II, V, VII y X). METODO EN UNA ETAPA
Fundamento

El método mide la formación de fibrina por acción de la trombina generada en un sistema coagulante que aporta todos los factores excepto el factor en estudio. El tiempo de coagulación del sistema es dependiente de la concentración del factor presente en la muestra problema.


Expresión de resultados

Los resultados se expresan en por ciento de actividad.

Curva de calibración: graficar en papel doble logarítmico la concentración del factor sobre la abscisa y los tiempos de coagulación (seg) sobre la ordenada. De la recta resultante, se interpola la concentración del factor presente en el plasma problema.
Interpretación de resultados

Valores normales: 70-120 %

El descenso de los niveles plasmáticos de los factores puede deberse a un déficit congénito (cuali o cuantitativo), adquirido, o a la presencia de inhibidores. Las deficiencias adquiridas pueden ser causadas por consumo, alteraciones en la función hepática, aumento en la actividad fibrinolítica o presencia de inhibidores.
Transformación fibrinógeno-fibrina
TIEMPO DE TROMBINA (TT)
Fundamento

Esta prueba mide el tiempo de coagulación del plasma citratado en presencia de trombina. Permite evaluar la transformación de fibrinógeno a fibrina.


Expresión de resultados

Se informa el tiempo de coagulación de la muestra (TT) expresado en segundos, junto con el tiempo de trombina del plasma normal.


Interpretación de resultados

Valores prolongados del TT pueden deberse a:

-Baja concentración de fibrinógeno (menor 200 mg/dL.), o ausencia del mismo (hipo o afibrinogenemia). Puede ser de origen congénito o adquirido. Los niveles de fibrinógeno plasmático pueden disminuir en hepatopatías severas, CID, por efecto del tratamiento con estreptoquinasa, r-tPA o L-asparaginasa, o también en respuesta a la actividad física.

-Presencia de un fibrinógeno anómalo (disfibrinogenemias congénitas o adquiridas)

-Inhibidores de la polimerización de los monómeros de fibrina, productos de degradación del fibrinógeno/fibrina o proteínas plasmáticas anormales.

-Tratamiento o contaminación con heparina

-Prolongaciones inespecíficas (hiperbilirrubinemia, hipoalbuminemia, hemólisis)

-Aumento muy marcado de fibrinógeno (>800-1000mg/dl)*


Valores acortados de TT: es muy controvertida su interpretación; algunas disfibrinogenemias trombóticas cursan con TT acortados.
*Los valores aumentados de fibrinógeno no suelen afectar el TT, excepto en situaciones particulares, como por ejemplo pacientes con síndrome nefrótico. Dado que el fibrinógeno es una proteína reactante de fase aguda, su concentración plasmática está aumentada en procesos infecciosos e inflamatorios, cirugía, sepsis, cáncer o ateroesclerosis y constituye un marcador de riesgo para eventos vasculares oclusivos. Los niveles de fibrinógeno aumentan con la edad, masa corporal, embarazo, tabaquismo, estrés y con el uso de anticonceptivos orales.
FACTOR XIII (FACTOR ESTABILIZADOR DE LA FIBRINA) PRUEBA DE SOLUBILIDAD DEL COAGULO
Introducción

Las pruebas de laboratorio fundadas en la medida del tiempo de coagulación no detectan los defectos o alteraciones del FXIII, dado que no participa en las reacciones que llevan a la formación de fibrina soluble. El FXIIIa actúa en una fase posterior, estableciendo uniones covalentes entre las moléculas de fibrina, transformándola en “insoluble”. La deficiencia severa de FXIII puede ser detectada por la disolución temprana del coágulo de fibrina en medio hidrofóbico (urea, ácido monocloroacético) (prueba de solubilidad del coágulo).



Fundamento

La prueba consiste en evaluar la presencia de un coágulo de fibrina insoluble (estable); el plasma del paciente, en presencia de iones calcio coagula, dicho coágulo de coloca en un medio hidrofóbico y se observa si se disuelve o no el coágulo. En pacientes con deficiencias severas del FXIII (≤1-5 U/dl) se produce un coágulo, que se disuelve tempranamente, comparado con los controles normales.


Expresión de resultados

Los resultados se expresan como normal (coágulo insoluble) o anormal (coágulo soluble).


Interpretación de resultados

En ausencia de FXIII o en presencia de concentraciones menores a 1-5U/dl (depende del método), el coágulo de fibrina se disuelve en el término de pocos minutos u horas. A pesar de su escasa sensibilidad, la técnica es útil para detectar defectos clínicamente importantes. Se requiere muy baja concentración de FXIII para obtener una hemostasia adecuada (valor hemostático: 1-5 U/dl).

Las alteraciones del FXIII pueden deberse a defectos cualitativos o cuantitativos, ya sean congénitos o adquiridos. La prueba de solubilidad puede dar anormal por la presencia de inhibidores específicos del FXIII.

COAGULÓMETRO AUTOMATIZADO

Son equipos utilizados para determinar cualquiera de las pruebas de hemostasia que utilicen método coagulométrico (TP, APTT, TT, Fibrinógeno, factores, etc.). Desde el punto de vista práctico ahorran tiempo para procesar muchas muestras (más de 30 en una mañana por Ej.) pero fundamentalmente logran altos grados de reproducibilidad.

Básicamente su funcionamiento se basa en dos métodos de detección: óptico (turbodensitometría) y/o magnético. Los que utilizan el método magnético toman el tiempo que tarda en formarse el coágulo desde el momento de mezcla hasta que una varillita de metal deja de girar. Los basados en métodos ópticos utilizan medidas de transmitancia para dar el tiempo de formación del coágulo.

Dentro de las funciones que pueden brindar estos equipos está la incubación de muestras por medio de fuentes secas, ésta se realiza por el tiempo estipulado para cada prueba que debe ser determinado por el operador o bien ya viene estandarizado en el equipo.

Cabe aclarar que en estos equipos se trabaja de modo muy similar al método manual en lo que se refiere a preparación de diluciones y curvas de actividad, la ventaja de estos equipos radica en agilizar el trabajo en caso de elevado número de muestras y la de permitir mayor reproducibilidad.

APTTest

Reactivos para la determinación del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada


SIGNIFICACION CLINICA


El tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), es una prueba sensible a la deficiencia de factores procoagulantes del plasma así como a la presencia de ciertos inhibidotes de la coagulación.

Sirve para detectar anormalidades en la vía intrínseca de la coagulación, como son los factores necesarios para la formación del activador intrínseco de la protrombina, o sea los factores VIII, IX, XI y XII.

También detecta deficiencias severas de los factores II, V, X y fibrinógeno, no siendo así con los trastornos plaquetarios, las deficiencias de los factores VII y XIII ni los problemas vasculares.

La rapidez, sencillez y reproducibilidad de la prueba la hacen muy adecuada para el control de la terapéutica anticoagulante por heparina. También permite la identificación rápida de hemofílicos en potencia, a fin de poder someterlos a tratamientos preventivos prequirúrgicos y evitar problemas hemorrágicos.


FUNDAMENTOS DEL METODO

El ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado en un baño a 37oC y en presencia de un exceso de cefalina, activador y calcio.


REACTIVOS PROVISTOS

Reactivo APTT: viales conteniendo cefalina con tierra de diatomeas como activador particulado.

Cloruro de Calcio: solución de cloruro de calcio 0,025 mol/l.
REACTIVOS NO PROVISTOS

Agua bidestilada o desionizada.


INSTRUCCIONES PARA SU USO

Cloruro de Calcio: listo para usar.

Reactivo APTT, preparación:

- Abrir un vial quitando el precinto metálico y retirando lentamente el tapón de goma para evitar pérdidas del material.

- Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase.

- Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor a 37°C

- Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensión homogénea. Volver a homogeneizar cada vez que se emplee.
PRECAUCIONES

Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".


ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10 °C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.

Reactivo APTT: una vez reconstituido es estable durante 14 días en refrigerador o 30 días congelado (-20 °C). El congelado y descongelado sólo puede realizarse una vez. Por esto se recomienda dividirlo en porciones, de acuerdo a las necesidades de trabajo.
MUESTRA

Plasma


a) Recolección: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de Anticoagulante TP de Wiener lab.). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos. Es recomendable efectuar la extracción con jeringas plásticas.

b) Aditivos: para obtener el plasma debe emplearse Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 0,130 mol/l.

c) Sustancias interferentes conocidas:

- Las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados.

- No debe emplearse EDTA o heparina para obtener plasma. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.

d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el plasma debe mantenerse en refrigerador (2-10°C) hasta el momento de efectuar la prueba. Este período no debe prolongarse más de 4 horas. En caso de no poder procesarse en este lapso, el plasma debe congelarse a -20°C. Este procedimiento al igual que el descongelado debe realizarse con rapidez (sumergiendo en baño a 37°C) previo a la determinación. La muestra debe conservarse hasta el momento de su análisis en tubos plásticos para minimizar los efectos de activación por contacto que pueden ocurrir con los tubos de vidrio.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

- Tubos de hemólisis.

- Pipetas y micropipetas capaces de medir los volúmenes indicados.

- Baño de agua a 37°C.

- Cronómetro.

- Fuente luminosa, para la observación del coágulo.


PROCEDIMIENTO

Precalentar el Cloruro de Calcio antes de realizar la prueba en baño de agua a 37°C.

En un tubo de hemólisis colocar:

Muestra (plasma desconocido o control) 100 ul

Reactivo APTT (homogeneizado) 100 ul

Mezclar e incubar de 3 a 5 minutos a 37°C, luego agregar: Cloruro de Calcio (a 37°C) 100 ul

Disparar simultáneamente un cronómetro. Agitar brevemente para homogeneizar el contenido, mantener en el baño unos 25 segundos. Luego sacar el tubo del baño, inclinar suavemente una vez por segundo y detener el cronómetro en el momento de la formación del coágulo. Tomar nota del tiempo de coagulación.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Los resultados pueden expresarse de distinta forma:

1) Como tiempo de tromboplastina parcial activada en segundos.

2) Como relación entre el tiempo obtenido con el desconocido y el de un plasma control.


METODO DE CONTROL DE CALIDAD

Plasma Control normal - patológico.


VALORES DE REFERENCIA

El intervalo de valores observados en individuos normales

oscila entre 33-48 segundos.

Se considera fuera de lo normal valores que difieran en más de 6 segundos de un plasma control.

Es recomendable que cada laboratorio procese un plasma control con cada lote de reactivos empleado y que correlacione los valores obtenidos para los pacientes con el de dicho plasma, haciendo constar estos resultados en el informe.
CURVA DE CALIBRACION

Este método es útil como control de la respuesta a la heparina en pacientes tratados con este anticoagulante.

La técnica empleada es la siguiente:

1) Preparar una Solución de Trabajo de heparina en solución fisiológica cuya concentración sea 10 Unidades/ml. Debe emplearse la misma heparina que se suministra al paciente.

2) Preparar diluciones de esta Solución de Trabajo utilizando un pool de plasmas frescos normales o Plasma Control normal como diluyente. Se deberán obtener diluciones de 0,8; 0,6; 0,4; 0,2; y 0,1 Unidades/ml.

3) Determinar el tiempo de tromboplastina parcial para cada una de estas soluciones así como para el pool de plasmas y graficar en papel semilogarítmico APTT vs. Concentración de heparina.

El valor obtenido para el paciente debe correlacionarse con los valores de la gráfica, para obtener la concentración actual de heparina circulante.


LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Ver Sustancias interferentes conocidas y Estabilidad e instrucciones de almacenamiento en MUESTRA.

El mecanismo de la coagulación involucra una serie de reacciones enzimáticas que pueden ser influenciadas por toda condición que afecte a los sistemas enzimáticos en general, razón por la cual se deben observar las mismas precauciones metodológicas.

Debe tenerse en cuenta que variaciones en la relación anticoagulante/muestra o en la concentración de citrato utilizada afectan los tiempos de tromboplastina parcial activada, por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra.


PERFORMANCE

Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvieron los siguientes resultados:


Nivel

D.S.

C.V.

45 seg

62 seg


+1,1 seg

+1,8 seg

2,5%

3,0%



PRESENTACION

Equipo para 150 determinaciones (6 x 2,5 ml) (Cód. 1705002).


BIBLIOGRAFIA

- Bell, W.N.; Alton, H.G. - Nature 174:880 (1954).

- Dacie, J.B.; Lewis, S.M. - Hematología Práctica – Ediciones Toray, 2º Edición (1970).

- Wintrobe, M.M. - Hematología Clínica 3ª Edición Intermédica (1969).

- Bragos, I; Rodríguez Pécora, S; Lorenzo, L; Capriotti, G. -

“Evaluación de un nuevo Reactivo de Tiempo Parcial de

Tromboplastina Activada” - 53º Triduo Bioquímico Científico Anual; Bahía Blanca (1988).

- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.




Soluplastin

Tromboplastina cálcica para la determinación del Tiempo

de Protrombina o Tiempo de Quick en una etapa


SIGNIFICACION CLINICA


El fenómeno de la coagulación puede desencadenarse por una “vía extrínseca” (lesión tisular) o por una “vía intrínseca” contacto de la sangre con epitelios distintos del vascular normal).

La determinación del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick es una prueba global para evaluar la coagulación extrínseca, siendo sensible a: factor II o protrombina, factor V o proacelerina, factor VII o proconvertina y factor X o Stuart-Prower.

Por lo tanto la determinación se aplica a:

- estudios de rutina en los análisis prequirúrgicos;

- detección de alteraciones en los niveles de uno o más factores involucrados en la vía extrínseca;

- control de la terapéutica con anticoagulantes orales.


FUNDAMENTOS DEL METODO

Este ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado a 37°C y en presencia de un exceso de tromboplastina tisular y calcio. El método no detecta deficiencias de factores de la vía intrínseca (VIII, IX, XI y XII).


REACTIVO PROVISTO

Soluplastin: viales conteniendo tromboplastina de cerebro de conejo, cloruro de calcio para una concentración final de 0,0125 mol/l y cloruro de sodio para una concentración final de 0,1 mol/l.
REACTIVO NO PROVISTO

Agua bidestilada o deionizada.


INSTRUCCIONES PARA SU USO

- Abrir un vial quitando el precinto metálico y retirando lentamente el tapón de goma para evitar pérdidas del material.

- Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase. Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor de 37°C.

- Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensión homogénea. Volver a homogeneizar cada vez que se emplee.


PRECAUCIONES

El reactivo es para uso diagnóstico "in vitro".


ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

Soluplastin provisto: estable en refrigerador (2-10°C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.

Soluplastin reconstituido: en refrigerador (2-10°C), es estable 5 días a partir del momento de su reconstitución.
MUESTRA

Plasma


a) Recolección: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de anticoagulante). Si se emplea Anticoagulante TP de Wiener lab., se requerirán 7 gotas para 4,5 ml de sangre). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos.

b) Aditivos: para obtener el plasma se debe emplear Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 0,130 mol/l.

c) Sustancias interferentes conocidas:

- las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados;

- la presencia de heparina o EDTA invalida los resultados;

- hemólisis visibles dificultan la medición foto-óptica de los resultados.

Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.

d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento:

el plasma debe mantenerse en el refrigerador (2-10°C) hasta el momento de efectuar el ensayo. En caso de no procesarse dentro de las 4 horas contadas desde la obtención, la muestra se debe congelar (a -20°C); de tal forma, puede conservarse durante un mes. Este último procedimiento debe ser realizado con rapidez, al igual que el descongelamiento (sumergiendo en baño a 37°C) previo a la determinación.


MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

- Tubos de hemólisis.

- Pipetas y micropipetas para medir los volúmenes indicados.

- Baño de agua a 37°C.

- Cronómetro.

- Fuente luminosa para la observación del coágulo.


PROCEDIMIENTO

1- Colocar el plasma (desconocido o control) en baño de agua a 37°C durante 2-3 minutos (no más de 10 minutos).

2- En un tubo de hemólisis, colocar 0,2 ml de Soluplastin reconstituido y preincubar a 37° C durante 2-3 minutos (no más de 10 minutos).

3- Pipetear 100 ul del plasma preincubado y agregar rápidamente al tubo conteniendo 0,2 ml de Soluplastin, disparando simultáneamente el cronómetro.

4- Mantener el tubo dentro del baño y cerca de una fuente de luz. Previo al tiempo estimado de coagulación, sacar el tubo del baño, inclinar suavemente una o dos veces por segundo y detener el cronómetro en el momento de la aparición del coágulo.

5- Calcular el tiempo promedio de coagulación de la determinación por duplicado para cada plasma (desconocido o control). Si la diferencia entre los replicados de una misma muestra es mayor del 5%, se aconseja repetir el procedimiento desechando los valores anteriores. En caso de emplear un instrumento de medición, deben seguirse las instrucciones del fabricante del mismo.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Los resultados pueden expresarse de distintas formas:



1- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en segundos.

2- Porcentaje de Actividad Protrombínica respecto de un plasma normal (100% de actividad): para ello se debe trazar la curva de actividad protrombínica de un pool de plasmas frescos normales.

Curva de calibración

En tubos de hemólisis, preparar 5 diluciones (cada una por duplicado) de un pool de por lo menos 3 plasmas normales o Plasma Control normal, según:




Diluciones

1:1

1:2

1:3

1:4

1:8

Porcentaje de actividad (%)

100

50

33,3

25

12,5

Pool plasmas normales (ml)

0,5

0,3

0,3

0,2

0,2

Solución fisiológica

-

0,3

0,6

0,6

1,4

Determinar el Tiempo de Protrombina para cada dilución, empleando el PROCEDIMIENTO descripto. En un papel milimetrado, graficar los resultados en un sistema de coordenadas. Colocar los Tiempos de Protrombina en segundos sobre el eje de las ordenadas y los Porcentajes de Actividad Protrombínica en el eje de las abscisas. Cada laboratorio debe trazar su propia curva de calibración, correspondiente al lote de reactivos en uso. Repetir con cada nuevo lote de reactivos.


3- Razón Internacional Normatizada (R.I.N.)

Para su cálculo, deberá emplearse la tabla de valores adjunta al equipo.


METODO DE CONTROL DE CALIDAD

Plasma Control normal - patológico.


VALORES DE REFERENCIA

El rango de valores obtenidos en pacientes normales oscila entre:

- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick: 10 - 14 seg

- Porcentaje de Actividad Protrombínica: 70 - 100%

Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos o valores de referencia. Para pacientes bajo tratamiento con antivitaminas K se ha establecido un rango terapéutico que se puede expresar como:

- Porcentaje de Actividad Protrombínica: 25 - 35%

- R.I.N.: 2,4 - 2,5
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.

Otras causas de resultados erróneos son:

- Extracción defectuosa de sangre venosa.

- Las variaciones en la relación anticoagulante/muestra o en la concentración de citrato utilizada afectan los Tiempos de Quick por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra.

- La preincubación en el 2o paso del PROCEDIMIENTO no debe exceder los 10 minutos indicados como límite máximo. Por otra parte, es conveniente que el reactivo reconstituido se retire del refrigerador inmediatamente antes de iniciar la prueba y vuelva a guardarse al finalizarla, ya que la exposición por varias horas a temperatura ambiente en forma reiterada, deteriora el reactivo produciendo el alargamiento de los tiempos de protrombina.


PERFORMANCE

a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día, se obtuvieron los siguientes datos:


X (n=20

D.S.

C.V.

11,5 seg

+0,4 seg

3,5%

21,2 seg

+0,6 seg

2,8%

b) Comparación con método de referencia: procesando distintas muestras con Soluplastin y con otro método tomado como referencia, se observa:



Reactivo

X (n=60)

D.S.

C.V.

Soluplastin

13,2 seg

+0,3 seg

2,3%

Referencia

12,8 seg

+0,3 seg

2,3%



PRESENTACION

- Equipo para 100 determinaciones (10 x 2 ml) (Cód. 1705001).

- Equipo para 10 x 20 determinaciones (10 x 4 ml) (Cód. 1705005).

- Equipo para 320 determinaciones (8 x 8 ml) (Cód. 1705003).


BIBLIOGRAFIA

- Quick, A.J. - “Fisiología y Patología de la Hemostasis” - Ed. El Ateneo, Buenos Aires (1952).

- Araldi, H.T., et al. - “Primer Reactivo Nacional Argentino de Referencia de Tromboplastina de Cerebro Humano” – Acta Bioquím. Clín. Latinoam. XVI/1:131 (1982).

- Comité de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biológicos - Inf. Nº 28: Normalización de la Vigilancia del Tratamiento Anticoagulante (oral) - Serv. Inf. Tec. Nº 610:49-56 (1977).

- Comité de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biológicos - Inf. Nº 31: Requerimientos para Tromboplastinas y Plasmas usados en la terapia anticoagulante oral - Serv. Inf. Téc. Nº 658:202-223 (1981).

- Suñer Casadevall, F. - “Nuevas Normas Internacionales para la Expresión del Tiempo de Quick” - Análisis Clínicos X/40:240-245 (1985).

- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.
Wiener lab.

2000 Rosario - Argentina

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Wiener Laboratorios S.A.I.C.

Riobamba 2944

2000 - Rosario - Argentina

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Bioquímica

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