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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

Facultad de Ciencias

Escuela de Bioquímica

Modulación aguda del transporte de Hexosas en Neuronas y Astrocitos

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de Licenciado en Bioquímica y al Título profesional de Bioquímico.

Profesor Patrocinante: Dr. Luis Felipe Barros O. - Centro de Estudios Científicos (CECS).

Anitsi Marcela Loaiza Díaz



Valdivia Chile 2003

Profesor Co-Patrocinante

Dra. Ilona Concha G. - Instituto de Bioquímica - Facultad de Ciencias.

Epigrafe

¡Oh , la profundidad de las riquezas y de la sabiduría y del conocimiento de Dios! ¡Cuan inescrutables son sus juicios e ininvestigables sus caminos!. “Romanos 11 : 33”

Dedicatoria

A mi querida mamá, a Ivi por ser una fuente de apoyo siempre.
Y a mis verdaderos amigos.

Agradecimientos

A mi guía académico el Dr. Felipe Barros por haber tenido la fe y paciencia en que mis esfuerzos en el desarrollo de esta tesis darían sus frutos. Su enseñanza y crítica científica como también su estímulo son un ejemplo para mí, que sin duda han influenciado en mi formación como Bioquímica.

A todos quienes conforman el laboratorio haciendo de este un templo del trabajo y saber. En especial, a los Drs. Francisco Sepúlveda, Pablo Cid y María Isabel Niemeyer quienes estuvieron siempre disponibles para entregar sus conocimientos y críticas científicas.

A Joel Castro por hacer ameno el ambiente de trabajo. A Carolina Montenegro, Carla Bittner e Ingrid Carvacho por sus buenos consejos y apoyo que iban más allá del ámbito académico.

A Dra. Ilona Concha y quienes forman parte de su equipo como Angara Zambrano y en especial a Carola Otth, quién con mucho esmero me enseñó técnicas fundamentales para el desarrollo de esta investigación.

A Roberto, mi esposo, quién estuvo siempre brindándome apoyo, compañía y ánimo en el desarrollo de esta. A mi familia: el abuelo Luis, mamá, papá y hermana que influyeron positivamente y me animaron a finalizar esta etapa de mi vida.

Esta tesis fue desarrollada en el laboratorio de Biofísica y Fisiología Molecular perteneciente al Centro de Estudios Científicos (CECS) y fue financiada por FONDECYT 1020648, proyecto de responsabilidad del Dr. Felipe Barros O. con el apoyo de la Fundación Andes.


1. RESUMEN


El transporte de glucosa es activado agudamente ante estrés metabólico en distintos tipos celulares, sin embargo, no se ha informado de tal modulación en células cerebrales, cuyo metabolismo es casi exclusivamente dependiente de glucosa. Este trabajo consistió en investigar si el transporte de glucosa en neuronas y astrocitos es estimulado por efecto del neurotransmisor excitatorio glutamato, inductor de estrés metabólico en estas células.

El desarrollo de este trabajo comprendió tres etapas. En la primera se caracterizaron los cultivos mixtos hipocampales, identificándose neuronas y astrocitos por criterios morfológicos, inmunocitoquímicos y funcionales. Además, se detectó la presencia de GLUT1 en astrocitos. En la segunda etapa, se desarrollaron dos métodos independientes de medición de captación de hexosas (galactosa y 2-NBDG), basados en microscopía confocal de epifluorescencia. Ambos métodos fueron efectivos en la medición del transporte de hexosas sensibles a citocalasina-B, sin embargo, se optó estudiar la modulación del transporte usando la hexosa fluorescente (2-NBDG) debido a su menor sensibilidad a artefactos de manipulación. La tercera etapa consistió en evaluar el efecto del glutamato sobre la captación de la hexosa. Contrario a lo esperado, el neurotransmisor inhibió en un 42 % la captación de 2-NBDG, fenómeno que fue reproducido por AMPA, un agonista de los receptores ionotrópicos de glutamato. Tanto la entrada de calcio como la entrada de sodio fueron identificadas como factores necesarios pero no suficientes para la inhibición por AMPA. En astrocitos el glutamato estimuló rápidamente, en el orden de segundos, la captación de 2-NBDG, fenómeno de interés para los modelos actuales de interacción metabólica entre neuronas y astrocitos.


SUMMARY


Glucose transport is activated by metabolic stress in different cell types, however modulation has not been reported in brain cells, whose metabolism is almost exclusive dependent of glucose. This study investigated if glucose transport in neurons and astrocytes is stimulated by the excitatory neurotransmissor, glutamate, and an inducer of metabolic stress in these cells.

This study comprised three parts. In the first, hippocampal mixed cultures were characterized, identifying neurons and astrocytes by morphological, inmunocytochemical and functional criteria. Also, GLUT1 was detected in astrocytes. The second part included the development of two independents assays of hexose (galactose and 2-NBDG) uptake, based in epifluorescence confocal microscopy. Both assays were effective at measuring, cytochalasin-B-sensitive hexose transport; however, we chose the fluorescent hexose (2-NBDG) to further study transport modulation due to its lower sensitivity to manipulation artifacts. The third part was an evaluation of the effect of glutamate on hexose uptake. Contrary to our expectation, the neurotransmissor inhibited 2-NBDG uptake by 42 %, phenomenon that was reproduced by AMPA, an ionotropic glutamate receptor agonist. Calcium and sodium entry were identifying as necessary factors but not sufficient for the inhibition by AMPA. In astrocytes, glutamate quickly stimulated, in the order of seconds, 2-NBDG uptake, phenomenon of interest for current models of metabolic interaction between neurons and astrocytes.


2. INTRODUCCION


El cerebro es uno de los órganos con mayor demanda energética, que a pesar de representar solo un 2% del peso corporal gasta el 20% del oxígeno y glucosa consumidos por el organismo.

La glucosa es prácticamente el único sustrato utilizado por el cerebro como combustible. Para acceder al parénquima cerebral esta molécula requiere atravesar las membranas celulares del endotelio que constituyen la barrera hematoencefálica (Cremer et al., 1979;Lund-Andersen, 1979). El transporte de la glucosa es mediado por los transportadores facilitativos GLUTs

(Figura 1) (Joost y Thorens, 2001). Se han identificado diferentes isoformas de los transportadores facilitativos de glucosa en el cerebro, siendo los principales GLUT1, GLUT3 y GLUT8. Las neuronas expresan abundantemente GLUT3 con menores densidades de GLUT1 GLUT8. Los astrocitos expresan sólo GLUT1 con la excepción de los astrocitos hipotalámicos que también expresan GLUT2 (ver tabla 1).

En neuronas, se acepta actualmente que la fosforilación de la glucosa por la hexoquinasa a glucosa-6-fosfato es la etapa limitante de su velocidad de consumo y no así su transporte. Por ejemplo, cultivos neuronales en estado de reposo mostraron que la fosforilación es la etapa limitante al constatar que en estado estacionario la concentración de glucosa intracelular era similar a la extracelular (Heidenrich et al., 1989), (Whitesell et al., 1995). Utilizando resonancia magnética nuclear en cerebros de rata se demostró que la distribución de glucosa en el espacio intra y extracelular permanecía igualmente distribuida (Pfeuffer et al., 2000). Sin embargo, otros grupos apuntan a que la velocidad del transporte puede llegar a ser limitante su velocidad de consumo. Estudios in vivo con microsensores en el intersticio del giro dentado de ratas muestran que la estimulación eléctrica local disminuye la concentración de glucosa intersticial en un 20 a 30% (Hu y Wilson, 1997). Estimulación de la actividad neuronal por microdialisis con veratridina, un agente despolarizante, muestra que el eflujo de glucosa al extracelular disminuye en el hipocampo, indicando que aumentaría el consumo de glucosa (van der Kuil y Korf, 1991). Ambos resultados sugieren que en condiciones de actividad las neuronas aumentarían su consumo de glucosa.

Trabajos en condiciones de estrés metabólico en sistemas neuronales indican que el transporte de glucosa ocupa un papel importante. Por ejemplo, episodios hipóxicos in vivo en el hipocampo de ratas generan disminución de la concentración de glucosa extracelular transitoriamente (van der Kuil y Korf, 1991), en condiciones de hipoxia in vitro provocan un aumento de la expresión de GLUT1 en astrocitos y GLUT3 en neuronas de cultivos primarios de cerebro de rata (Bruckner et al., 1999), en condiciones de isquemia cerebral se ha observado in situ sobreexpresión de GLUT3 en neuronas de la corteza cerebral (Urabe et al., 1996).

En diversos sistemas celulares las condiciones de estrés metabólico incrementan el transporte de glucosa aguda o tardíamente. Aumento del pH, inhibición de la fosforilación oxidativa, hipoxia o deprivación de glucosa aumentan la velocidad de transporte de glucosa. La estimulación rápida del transporte de glucosa puede ser resultado de la activación de transportadores pre-existentes en la membrana plasmática o de la translocación de transportadores desde sitios intracelulares (Ismail-Beigi, 1993). Por ejemplo, la línea celular de fibroblastos de ratón swiss 3T3 presenta una estimulación rápida del transporte inducida por un aumento de Cai2+ con un t1/2 de aproximadamente 4 min. (Kitagawa, 1987). GLUT1 es modulado agudamente por estrés metabólico, como se ha demostrado por varios grupos, incluido el nuestro (Baldwin et al., 1997;Hamrahian et al., 1999). En la línea celular hepática Clone-9, GLUT1 responde al estrés metabólico con un incremento en su actividad intrínseca, el cual parece ser

mediado por la proteína quinasa activada por AMP (AMPK)(Barnes et al., 2002). En estas células la actividad de GLUT1 es también modulada agudamente por la concentración citosólica de calcio (Quintanilla et al., 2000b). La actividad de GLUT3 es estimulada de manera aguda ante la exposición a trombina en plaquetas con un t1/2 de 1-2 min como consecuencia de la translocación del transportador (Sorbara et al., 1997).

En actividad sináptica las neuronas del sistema nervioso central liberan glutamato desde los terminales presinápticos, la interacción del neurotransmisor con sus receptores específicos en los terminales postsinápticos generan potenciales excitatorios. Cuando la actividad sináptica se incrementa, la liberación excesiva de glutamato resulta tóxica para las neuronas. Episodios epilépticos, isquemia e hipoglicemia provocarían una excesiva excitación neuronal (excitotoxicidad) (Lynch y Guttmann, 2002). Se ha descrito que la excitotoxicidad provocada por altos niveles de glutamato altera la homeostasis del calcio y sodio en las neuronas resultando en aumento intracelular de estos iones (Choi, 1987). Concentraciones elevadas de calcio intracelular inducen una sobrecarga de Ca2+ por la mitocondria causando disipación del potencial de su membrana (Schinder et al., 1996), disminuyendo la producción de energía aeróbica y aumentando la producción de especies reactivas de oxígeno (Dugan et al., 1995;Reynolds y Hastings, 1995), condiciones de estrés metabólico celular. Posteriormente los niveles aumentados de calcio también activan proteasas, fosfolipasas y nucleasas dependientes de calcio resultando en toxicidad y finalmente en muerte neuronal (Rothman y Olney, 1987), (Orrenius et al., 1989), (Miller et al., 1992).



FIGURA 1. Modelo esquemático de las proteínas GLUT. Con sus 12 α-hélices dominios transmembrana. Superior, GLUTs clase I (GLUT1, GLUT3, GLUT4, GLUT2). Inferior, GLUTs clase III (GLUT6, GLUT8, GLUT10, GLUT12). Los residuos altamente conservados tienen el fondo blanco y los propios de la clase con fondo negro (modelo obtenido de Joost HG, Molecular Membrane Biology, 2001, 18, 247-256). Al extremo carboxilo terminal son afines los anticuerpos anti-GLU1 y anti-GLUT3 usados en este trabajo.

TABLA 1. Familia de Transportadores facilitativos de glucosa GLUTs.



Transportador

Sitios de expresión/Función

Referencia

GLUT1

eritrocitos, barreras titulares sanguíneas.

Vannucci S., et al, 1997 (Glia, 21:2-21)

(55kDa)

cerebro: barrera hematoencefálica.




(45kDa)

mayoría células corporales: transporte basal.







cerebro: glias, neuronas, plexo coroides, epéndimo.




GLUT2

hígado, riñón, páncreas; transportador con alta Km, sensor de liberación de glucosa.







cerebro: hipotálamo; astrocitos.




GLUT3

Placenta, espermios, plaquetas; transportador con Km muy baja, alta velocidad de transporte.







cerebro: corteza, hipocampo, neurohipófisis, cerebelo, núcleo caudado. Neuronas.




GLUT4

corazón, músculo, tejido adiposo; transportador sensible a insulina.







cerebro: cerebelo, hipocampo. neuronas, microvasos cerebrales.




GLUT5

intestino delgado, macrófago, espermios; transportador de fructosa.







cerebro: microglia y células endoteliales microvasculares.




GLUT6

pseudogen




GLUT8

hígado, glándula adrenal, bazo, tejido adiposo, pulmones, testículos.

Ibberson M., et al, 2000 (JBC, 275: 4607-12)




cerebro: cerebelo, hipocampo, hipotálamo







neuronas excitadoras e inhibitorias hipocampales.

Reagan L., et al, 2002; (Brain Res. 932: 129-34)

GLUT9

bazo, leucocitos y cerebro.

Doege H., et al, 2000(Biochem J., 350: Pt3, 771-6)




riñón e hígado



Phay J. E., et al, 2000 (Genomics, 66 (2) : 217-20)

GLUT10

corazón, pulmón, hígado, musculo esquelético, páncreas, placenta, riñón y cerebro humanos. cerebro e hígado fetal.

Dawson PA, et al, 2001

(Mol Genet Metab. 4:186-99)






niveles mayores en hígado y páncreas. niveles menores en corazón, placenta, músculo esquelético y riñón.

McVie-Wylie AJ, et al, 2001

(Genomics ; 72:113-7)



GLUT11

corazón y músculo esquelético humanos. Transportador de fructosa con baja afinidad por glucosa.

Doege H., et al, 2001(Biochem. J., 359:443-9)


GLUT12

corazón, próstata.


Rogers, S., et al, 1998 (Diabetes, 47 A45)

El objetivo principal de este trabajo fue investigar el efecto de glutamato, neurotransmisor excitatorio, sobre el transporte de glucosa en neuronas y astrocitos. Para esto utilizamos cultivos mixtos de hipocampo de rata, donde las neuronas crecen en condiciones más fisiológicas al interactuar con otras células no-neuronales como astrocitos (Laming et al., 2000). La medición del transporte de glucosa requirió el uso de métodos que permitan diferenciar los tipos celulares que componen el cultivo mixto. Métodos basados en microscopía confocal de epifluoresencia permiten medir el transporte de hexosas a nivel de célula única, que a diferencia de los tradicionales métodos isotópicos, no requieren poblaciones celulares puras.

Los métodos de transporte de hexosas fluorimétricos usados fueron de tipo indirecto y directo. El primero se basa en registrar los cambios de volumen celular provocados por la entrada de osmolitos como la galactosa. A partir de estos cambios de volumen es posible determinar la concentración intracelular de la hexosa. Este método permite efectuar mediciones sucesivas sobre las mismas células en tiempo real, pudiendo obtenerse tasas de velocidades iniciales y variaciones de la Vmáx, debido que la condición de captación es cis-infinito (Barros, 1999). Por otro lado, el segundo método está basado en el uso del azúcar fluorescente 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-2-desoxiglucosa (2-NBDG), análogo fosforilable de glucosa, usado como sustrato de transportadores de glucosa en diversos sistemas de células eucariontes (Speizer et al., 1985), (Yamada et al., 2000), (Roman et al., 2001). El uso de concentraciones bajas de esta azúcar, transportada a velocidad lenta (Yamada et al., 2000) (Cloherty et al., 1995) permite hacer mediciones de transporte en condiciones de cero-trans a temperatura ambiente, lo cual facilita la observación de fenómenos de modulación del transporte.

Ambos ensayos de captación de hexosas a nivel de célula individual fueron aplicados a los cultivos hipocampales mixtos establecidos para explorar los posibles cambios de captación de hexosas asociadas al fenómeno de la actividad sináptica aumentada. Los resultados de esta tesis demostraron que la actividad neuronal provocada por glutamato, inhibe el transporte de glucosa en neuronas y la estimula agudamente en astrocitos. Este nuevo resultado apoya el modelo propuesto de acoplamiento metabólico neuronal-astrocítico y representa la modulación más rápida del transporte de glucosa reportada hasta ahora.

HIPÓTESIS DE TRABAJO

El glutamato induce un aumento del transporte de glucosa en neuronas.



OBJETIVO GENERAL

Determinación si el glutamato provoca un aumento del transporte de hexosas en neuronas y astrocitos hipocampales de rata en cultivo mixto.



OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Establecimiento y caracterización de los cultivos hipocampales mixtos de neuronas y astrocitos de rata. Identificación de estas células por criterios morfológicos, inmunológicos y funcionales.

Caracterización de la expresión de los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3 en los cultivos mixtos a través de ensayos de inmunocitoquímica y Western Blot.

Desarrollo de dos métodos independientes para medir el transporte de hexosas a nivel de célula única y determinación de las bondades relativas de estos dos métodos en nuestro sistema experimental.

Determinación si la exposición a glutamato aumenta el transporte de hexosas en neuronas y astrocitos.


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2003 -> Estudio de los parámetros de vida de Oligonychus yothersi Mc Gregor (Acarina: Tetranychidae) en dos cultivares de palto (Persea americana Mill.), Hass y Fuerte
2003 -> Implementación y evaluación de un programa de atención farmacéutica en pacientes hipertensos en farmacia comunitaria
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2003 -> Universidad austral de chile facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia Estudio fitoquímico y evaluación de las actividades analgésicas y antiinflamatorias de una especie altiplanica Chilena, Malesherbia Auristipulata Ricardi


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