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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

Facultad de Ciencias

Escuela de Bioquímica

Análisis de posibles sitios de unión para Apolipoproteina A-I en membranas de ribete en cepillo aisladas del intestino del pez Cyprinus carpio

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de Licenciado en Bioquímica y al título profesional de Bioquímico.

Profesor Patrocinante: Sr. Rodolfo Amthauer Matthei - Instituto de Bioquímica - Facultad de Ciencias.

Nadya Andrea Báez Alvarez

Valdivia Chile 2004

Agradecimientos

Quisiera agradecer en primer lugar al Dr. Rodolfo Amthauer M. y a la Dra. Margarita Concha G., por permitirme formar parte de su grupo de trabajo, pero muy especialmente por su continuo apoyo, paciencia, consejos y sabia experiencia, las que indudablemente fueron de gran ayuda durante el desarrollo de esta tesis, en mi formación como profesional y como persona.

Quiero hacer partícipes en mis agradecimientos a los profesores informantes: Dra. Margarita Concha y al Dr. Alejandro Reyes, por sus aportes en la corrección de ésta tesis.

Me gustaría agradecer especialmente a la Dra. Margarita Concha por los gratos momentos de conversación, por escucharme y por saber aconsejarme.

A la profesora Julieta Villanueva por su buena disposición cada vez que me entregó sus conocimientos y por su gran calidez humana. También quiero agradecer a mis compañeros Cristian Echeverría, Cristian Santander, Carlos Flores, Andrea Hidalgo, Marcelo Salazar, Karina Castro, Romina Bertinat, Adriana Bastías, Rodrigo López por su amistad desinteresada, apoyo y comprensión.

Finalmente quiero agradecer a todos los integrantes del Instituto de Bioquímica por los buenos momentos compartidos y por su colaboración.

El financiamiento para el desarrollo de esta tesis fue obtenido del proyecto Fondecyt 1980993 y DID-UACH200121.

LISTAS DE ABREVIATURAS


ANS : ácido 8-anilino-1-naftaleno sulfónico

ApoA-I : apolipoproteína A-I

BBM : membranas de ribete en cepillo

BCIP : 5-Bromo 4-Cloro-3-indolil fosfato

BLM : membranas basolaterales

BSA : albúmina de suero bovino

EDTA : ácido etilendiaminotetracético

G : fuerza de gravedad

H : hora

HDL : lipoproteína de alta densidad

HRP : peroxidasa de rábano picante

KDa : kiloDalton

NBT : azul de nitro tetrazolio

Nm : nanómetro

PMSF : fluoruro de sulfonilmetano

p/v : peso/volumen

SDS : dodecilsulfato de sodio

TEMED : NNN’, N’-tetrametilenetilendiamina

Tris : tris (hidroximetil)-aminometano

v/v : volumen/volumen



VLDL : lipoproteína de muy baja densidad

1. RESUMEN


En varias especies de peces teleósteos la lipoproteína de alta densidad (HDL) y su principal apolipoproteína (apoA-I) constituyen la fracción proteica mayoritaria del plasma postulándose que jugaría un rol central en el metabolismo lipídico. Estudios realizados en la carpa (Cyprinus carpio) demuestran que, a diferencia de lo que ocurre en mamíferos, los lípidos de la dieta absorbidos en el intestino aparecerían mayoritariamente asociados a HDL y no a quilomicrones o VLDL. Sin embargo, aún cuando la apoA-I se ha inmunodetectado en el lumen intestinal y en enterocitos, su síntesis no ha podido ser demostrada en el intestino de la carpa. Teniendo presente su abundancia en el lumen intestinal, es probable que apoA-I se origine en el sistema hepato-biliar siendo luego secretada a la bilis durante la absorción de lípidos. Estudios preliminares sugieren que la apoA-I se asociaría a membranas de ribete en cepillo (BBM) y luego sería internalizada en forma intacta al enterocito donde contribuiría a movilizar los lípidos de la dieta. Para dilucidar el posible mecanismo de internalización de apoA-I se analizó la interacción de esta proteína con BBM aisladas. Se purificó tanto HDL como apoA-I desde el plasma de carpa y de trucha y la apoA-I de trucha se utilizó como un sistema heterólogo para facilitar la interpretación de los resultados de los ensayos de unión y “ligand blot” en presencia de apoA-I endógena, mediante la detección selectiva de apoA-I de trucha con un anticuerpo específico. A pesar de esta estrategia no se detectó ninguna proteína de BBM capaz de unir específicamente apoA-I de trucha. Resultados similares se obtuvieron utilizando apoA-I de carpa marcada con 125I en los ensayos de “ligand blot”, lo que sugiere que la interacción de apoA-I con BBM no involucraría una clásica unión proteína- receptor.

SUMMARY


In several teleost species, high density lipoprotein (HDL) and its main apolipoprotein (apoA-I) constitute the main plasma protein fractions, suggesting that they would play a central role in the lipid metabolism. Studies performed in the carp fish (Cyprinus carpio) show that, unlike what happens in mammals, the dietary lipids absorbed by the intestine appear mainly associated to plasma HDL and not to chylomicrons or VLDL. However, even though apoA-I is immunodetected in the intestinal lumen and inside the enterocyte, its synthesis could not be demonstrated in the carp intestine. Considering the abundance of apoA-I in the intestinal lumen, it is probable that it is originated by the hepato-biliary system and then released to the bile during lipid absorption. Preliminary studies suggest that apoA-I would then associate to brush-border membranes (BBM) being internalized in intact form by enterocytes, where it would contribute to mobilize dietary lipids. In order to explain the possible mechanism of internalization of apoA-I, the interaction of this protein with isolated BBM was analyzed. Both, HDL and apoA-I were purified from carp and trout plasma and the trout apoA-I was used as a heterologous system that allows a better interpretation of the binding and ligand blotting experiments in the presence of endogenous apoA-I through immunodetection with a specific antibody against trout apoA-I. In spite of this approach we could not detect any BBM protein able to bind specifically to trout apoA-I. Similar results were obtained using 125I-labelled carp apoA-I in the ligand blotting assays suggesting that a classic ligand-receptor binding is not involved in the interaction of apoA-I with BBM.

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