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UNIVERSIDAD DE CHILE

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica

Laboratorio de Farmacoterapia Génica



DIFERENCIAS GENÉTICAS ENTRE RATAS ABSTEMIAS (UChA) Y BEBEDORAS DE ALCOHOL (UChB) EN LOS GENES DE SIETE SUBUNIDADES DEL COMPLEJO I CODIFICADAS EN EL GENOMA MITOCONDRIAL

MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE BIOQUÍMICO



GINEZ ANDRÉS GONZÁLEZ MARTÍNEZ

Patrocinante y Directora de Memoria

Dra. Amalia Sapag Muñoz de la Peña

Santiago, Chile

2007

Esta memoria se realizó en el Laboratorio de Farmacoterapia Génica con fondos provenientes del Proyecto FONDECYT 1050480 y, a la fecha (Agosto de 2007), ha dado origen a las siguientes comunicaciones.

Sapag A, González-Martínez G, Encina L, Lobos-González L,

Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y.

“Four complex I proteins encoded in the mitochondrial genome are different in low drinker UChA and high drinker UChB rats” Panel

30th Annual Scientific Meeting of the Research Society on Alcoholism (RSA).

Hyatt Regency Chicago, Chicago, Illinois, EE.UU. 7-12 de Julio, 2007

Alcoholism: Clinical and Experimental Research 31(6) Suppl.: 192A, 733 (2007)



González-Martínez G.

“Beber o no beber alcohol: el poder de los genes” Oral

XII Semana Nacional de la Ciencia y Tecnología.

Colegio Teresiano Enrique de Ossó, Santiago, Chile. 5 de Octubre, 2006

Sapag A, González-Martínez G, Lobos-González L,

Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y.

“Maternal inheritance, mitochondrial complex I and alcohol consumption: differences between nondrinker (UChA) and drinker (UChB) rats in three mitochondrial genes” Panel

13th Congress of the International Society for Biomedical Research on Alcoholism (ISBRA).

Wentworth Sydney, Sidney, Australia. 10-13 de Septiembre, 2006

Alcoholism: Clinical and Experimental Research 30(9) Suppl.: 155A, 810 (2006)



González-Martínez G, Lobos-González L, Sapag A,

Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y.

“Herencia materna en alcoholismo: genes del complejo I mitocondrial. Diferencias entre ratas bebedoras de alcohol (UChB) y abstemias (UChA)” Oral

XXIII Congreso de la Asociación Nacional de Estudiantes de Bioquímica (ANEB).

Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile. 2-4 de Agosto, 2006

Libro de resúmenes, página 31.



González-Martínez G, Lobos-González L, Sapag A,

Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y.

“Alcoholismo y herencia materna: diferencias en genes del complejo I mitocondrial entre ratas abstemias (UChA) y bebedoras de alcohol (UChB)” Panel

XXVIII Reunión Anual de la Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile.

Centro de Convenciones Paso Pehuenches, Talca, Chile. 9-12 de Enero, 2006

Libro de resúmenes, página 43.



González-Martínez G, Sapag A, Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y.

“Búsqueda de factores genéticos mitocondriales que determinan aversión al alcohol: diferencias entre ratas UChA y UChB” Panel

XLVIII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Chile.

Gran Hotel Pucón, Pucón, Chile. 13-16 de Octubre, 2005

Biological Research 38: R-88, 20 (2005)

“ El hecho de que tenga los pies en la tierra es sólo una casualidad ”

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar agradecer a mi madre y a mi hermano por la paciencia (que probablemente yo no la hubiese tenido) y el apoyo durante toda la carrera, en especial, durante el período de redacción de la tesis. También a mi padre, por su apoyo.

A mis profesores, en especial a mi directora de tesis Dra. Amalia Sapag, no sólo por su gran dedicación y entrega en temas científicos sino también por sus consejos en el ámbito profesional. Además, agradecer muy especialmente al director del laboratorio Dr. Yedy Israel por su gran aporte a este trabajo. Gracias a ambos por la paciencia que han tenido conmigo.

A mis compañeros de laboratorio, Gabriel, Gonzalo, Giuliana, Javier, Mario, Paula, y Robel, por sus aportes en temas científicos, de diario vivir y por compartir momentos recreacionales en el Santa Inés.

También, muy especialmente a mis compañeros y amigos de la generación que entró el año 2000 a la carrera Bioquímica y a los que he ido conociendo durante el transcurso de la tesis. Con todos ellos he compartido una etapa importante de mi vida y que no se olvidará jamás.

Al final, pero no menos importante, a mis amigos del mundo exterior que hacen de cable a tierra y ayudan a pensar en otras cosas. En especial a mi gran amigo del colegio Jorge, a mis compañeros de baby-fútbol, y a los amigos de parranda.

Abreviaturas

ALDH2:deshidrogenasa aldehídica mitocondrial

DNA:ácido desoxirribonucleico

EDTA:etilendiaminotetraacetato

FAD:flavina adenina dinucleótido

gDNA:ácido desoxirribonucleico genómico

Km:constante de Michaelis-Menten

mRNA:ácido ribonucleico mensajero

NAD+:nicotinamida adenina dinucleótido

nt:nucleótido

pb:pares de bases

PCR:reacción en cadena de la polimerasa

RNA:ácido ribonucleico

UV:ultravioleta



Resumen

La predisposición al alcoholismo está en gran parte determinada por factores genéticos que son difíciles de abordar en humanos, por lo que se han desarrollado en el mundo líneas de ratas bebedoras y no bebedoras de alcohol para estudiar los factores permisivos y protectores del alcoholismo. En Chile se encuentran la línea UChA (Universidad de Chile, Abstemias) y la línea UChB (Universidad de Chile, Bebedoras) que corresponden a ratas derivadas de la cepa Wistar. Las ratas UChA beben entre 0,1 y 1 g de etanol/kg/día, en cambio las ratas UChB beben entre 4 y 6 g/kg/día.

En la rata y el hombre la metabolización del etanol ocurre principalmente en el hígado, donde la deshidrogenasa alcohólica (ADH) transforma el etanol en acetaldehído que es transformado en acetato por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). La ADH y la ALDH2 utilizan NAD+ como cofactor en las reacciones de oxidación.

El linaje UChA se diferencia del linaje UChB en el gen Aldh2: el alelo Aldh22 se encuentra exclusivamente en el linaje UChA y los alelos Aldh21 y Aldh23 se encuentran en el linaje UChB, siendo el alelo Aldh23 exclusivo del linaje bebedor. Además, el linaje UChA se diferencia del UChB en la capacidad de generación de NAD+ de las mitocondrias: menor en las mitocondrias del linaje UChA que en las del linaje UChB.

En ratas, la variante ALDH23 es suficiente para generar un consumo elevado de alcohol, independientemente de la mitocondria que posean. En cambio, la variante ALDH22 es necesaria pero no suficiente para determinar un bajo consumo de alcohol, fenotipo que sí se manifiesta cuando, además de la ALDH22, las ratas tienen mitocondrias de menor capacidad de generar NAD+. Las diferencias en las capacidades respiratorias mitocondriales se deben al complejo I (deshidrogenasa de NADH) formado por 46 subunidades. Nueve de ellas son de herencia exclusivamente materna, dos codificadas en el cromosoma X y siete en el genoma mitocondrial. En esta memoria se estudiaron los genes mitocondriales que codifican subunidades del complejo I de las ratas UChA y UChB con el propósito de identificar las bases moleculares de las diferencias bioquímicas entre ambos linajes.

Se amplificaron, secuenciaron y analizaron, de cinco ratas UChA (Aldh22/Aldh22) y cinco ratas UChB (Aldh23/Aldh23), siete genes mitocondriales que codifican sendas subunidades del complejo I mitocondrial. No se encontró heteroplasmia puesto que hay un sólo tipo de mitocondria por linaje, es decir, para cada gen, las cinco ratas UChA son iguales entre sí y las cinco ratas UChB también son iguales entre sí.

Se encontró que las ratas UChA (no bebedoras) y UChB (bebedoras de alcohol) se diferencian en los genes mitocondriales Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5 y Nd6 del complejo I. No se encontraron diferencias nucleotídicas en el gen Nd4L. Los genes Nd1 y Nd3 sólo tienen diferencias nucleotídicas silentes mientras que los genes Nd2, Nd4, Nd5 y Nd6 tienen además diferencias nucleotídicas conducentes a cambios aminoacídicos, por lo que ambos linajes difieren en cuatro proteínas. Las subunidades ND2 se diferencian en cuatro posiciones aminoacídicas, (UChA/UChB) posiciones 150 (Ser/Asn), 265 (Thr/Ala), 304 (Met/Thr) y una inserción de histidina en la posición 318 (His/---). Estas variaciones aminoacídicas en la proteína ND2 determinan cambios estructurales que se manifiestan de manera evidente en un modelo tridimensional y en el número de segmentos de transmembrana: nueve en el linaje UChA y diez en el linaje UChB. Las subunidades ND4 se diferencian en las posiciones 23 (Thr/Ile) y 419 (Pro/Leu), las subunidades ND5 se diferencian en la posición 37 (Val/Ile) y las subunidades ND6 en la posición 139 (Val/Ile).

Siete de las catorce secuencias genéticas obtenidas en este trabajo son variantes nuevas entre los roedores: los genes Nd1, Nd5 y Nd6 de ambos linajes y el gen Nd4 del linaje UChA. Las secuencias aminoacídicas deducidas de la subunidad ND5 de los linajes UChA y UChB y la secuencia aminoacídica deducida de la subunidad ND4 del linaje UChA corresponden a secuencias proteicas nuevas entre los roedores.

Concluyendo, los polimorfismos génicos aquí reportados en subunidades del complejo I mitocondrial, en especial los responsables de variaciones aminoacídicas, pueden establecer nuevos factores (permisivos o protectores) de herencia exclusivamente materna que influyen en la capacidad mitocondrial de regenerar el NAD+ y, por lo tanto, en el consumo de alcohol.

SUMMARY


Genetic differences between alcohol nondrinker rats (UChA) and drinker rats (UChB) in the genes for seven subunits of complex I encoded in the mitochondrial genome”

The predisposition to alcoholism is determined mainly by genetic factors. Given the complexity of unraveling these factors in humans several lines of alcohol drinker and nondrinker rats have been bred around the world in order to study permissive and protective factors in alcoholism. In Chile there are two Wistar derived lines of rats: the UChA lineage (Universidad de Chile, Abstemious) and the UChB lineage (Universidad de Chile, Bibulous). UChA rats drink between 0.1 and 1 g of ethanol/kg/day whereas UChB rats drink between 4 and 6 g/kg/day.

In the rat and in man alcohol is metabolized mainly in the liver where alcohol dehydrogenase (ADH) transforms ethanol into acetaldehyde which is then transformed into acetate by mitochondrial aldehyde dehydrogenase (ALDH2). Both ADH and ALDH2 use NAD+ as cofactor for the oxidation reactions.

The UChA and UChB lineages differ in the Aldh2 gene: the Aldh22 allele is found only in the UChA line while alleles Aldh21 and Aldh23 are both common in the UChB line, the latter being exclusively present in drinker rats. The UChA and UChB lineages also differ in the capacity of their mitochondria to generate NAD+: the UChA line has a lower capacity than the UChB line.

In rats, the ALDH23 variant determines a high alcohol consumption phenotype independently of the type of mitochondria. In contrast, the ALDH22 variant is necessary, but not sufficient, to determine a low alcohol consumption phenotype which develops only when rats also carry mitochondria with a low capacity to generate NAD+. The differences in the respiratory capacity of the mitochondria from both lineages has been ascribed to complex I (NADH dehydrogenase), a macromolecular assembly of 46 subunits, nine of which are inherited exclusively through the maternal line; of these, two are encoded in the X chromosome and seven in the mitochondrial genome. In this work, the mitochondrial genes encoding complex I subunits from the UChA and UChB rat lines were studied with the purpose of identifying the molecular basis for the biochemical differences between both lineages.

The seven mitochondrial genes which encode subunits of mitochondrial complex I were amplified from the genomic DNA of five UChA (Aldh22/Aldh22) rats and five UChB (Aldh23/Aldh23) rats and were then sequenced and analysed. Heteroplasmy was not apparent given that a single type of mitochondria for each lineage was found; the five UChA rats were identical for each gene as were the five UChB rats amongst them.

It was found that the nondrinker UChA rats differ from the drinker UChB rats in six mitochondrial genes of complex I, namely Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5 and Nd6, while no nucleotide differences were found in the Nd4L gene. There are only silent nucleotide differences in the Nd1 and Nd3 genes whereas genes Nd2, Nd4, Nd5 and Nd6 have both silent variations and nucleotide differences which lead to amino acid changes, thus establishing that both lineages differ in four proteins. The ND2 subunits have four variations found at positions (UChA/UChB) 150 (Ser/Asn), 265 (Thr/Ala), 304 (Met/Thr) and 318 where a single amino acid insertion was detected (His/---). These amino acid variations in the ND2 protein determine structural changes which are evident in a three dimensional model and in the number of predicted transmembrane segments, nine in the UChA protein and 10 in the UChB protein. The ND4 subunits differ in residues 23 (Thr/Ile) and 419 (Pro/Leu). The ND5 subunits differ only in residue 37 (Val/Ile) and the ND6 subunits vary in residue 139 (Val/Ile).

Seven of the fourteen gene sequences obtained in this work are new variants for rodents: the Nd1, Nd5 and Nd6 genes of both lineages and the Nd4 gene of the UChA line. Likewise, the deduced amino acid sequences for the ND5 subunit of both lineages and the ND4 subunit of the UChA line are new protein sequences amongst rodents.

Overall, the nucleotide polymorphisms reported herein for subunits of the mitochondrial complex I, particularly those accounting for amino acid variations, may establish new (permissive or protective) factors inherited through the maternal line that influence the mitochondrial capacity to generate NAD+ and hence the alcohol drinking behavior.




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