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UNIVERSIDAD DE CHILE

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica



Muerte celular de fibroblastos y miofibroblastos cardiacos neonatos por sobre-expresión de los receptores tipo 1 y 2 de angiotensina II


Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico

CRISTIAN ORLANDO SOTO CASTRO

Patrocinante : Dr. Guillermo Díaz-Araya.

Directores de tesis : Dr. Guillermo Díaz-Araya.

Dr. Juan Pablo Muñoz.


Santiago, Chile

2006


AGRADECIMIENTOS
Primero que todo quiero agradecer al Dr. Guillermo Díaz-Araya por darme la oportunidad de conocer el mundo de la ciencia y a sus habitantes, por estar dispuesto a ayudarme cuando lo necesité y por todo el apoyo que me dio durante este último año.

A mi familia, a mis padres Orlando y Luz, por guiarme y darme todas las armas para triunfar en la vida, nada de esto fue fácil, azotados constantemente por cesantías, peleas y separaciones… sin embargo nunca perdieron el norte y supieron dejarme en la otra orilla como Caronte. A mis hermanos Natalia, Valeria y Sebastián (en orden descendente) por completar mi entorno y hacer más “divertidas” mis horas en casa. A mis abuelos Orlando, Celma, Magali y José por su eterno apoyo y cariño.

Si miro alrededor estas tú, mi compañera de viaje y de locuras, me apoyaste en todo y me abriste los ojos cuando era necesario, de formas simples y otras más dolorosas pero siempre con amor (aun cuando estaba oculto), nunca terminaré de conocerte y no me importa, creo que ahora por fin, después de cinco años de saltar sobre ese globo rojo (lo recuerdas?), es cuando todo empieza entre nosotros, contare de nuevo desde cero como querías, lo único que necesito es que no te muevas, gracias Giselle.

A mis amigos de la Universidad, de los cinco años más extraños de mi vida, a la cual entre esperando una cárcel mental y gracias a uds. fue solo una continuación del eterno recreo de mi vida. Ricardo, Manuel, Alexander, Sebastián, todavía estamos juntos!… Para los que por distintos motivos fueron desapareciendo: Mauricio, Smolic, Jorge, etc. gracias por el tiempo dedicado. Espero contar con uds. mucho tiempo más, ninguno es desechable, y así poder jugar en algún torneo de fútbol amateur, comer sushi, hacer asados y tal vez en alguna dimensión paralela a esta, viajar más allá de El Quisco, a Buzios, por ejemplo.

Todos serán eternos en mi, cada parte que me forma tiene una inicial, si observan con cuidado encontraran la suya.

Por último a mis compañeros de laboratorio: Valentina, Diego, JP, Pablo, Hernán, Miguel, David y en los últimos días Raúl y Carlos, por hacer del laboratorio un lugar de diversión y aprendizaje.


A todos ustedes muchas gracias.



ÍNDICE GENERAL



ÍNDICE GENERAL 3

ÍNDICE DE FIGURAS 4

ABREVIATURAS 5

RESUMEN 7

SUMMARY 8

1. INTRODUCIÓN 9

2. HIPÓTESIS 13

3. OBJETIVO GENERAL 13

4. OBJETIVOS ESPECIFICOS 14

5. MATERIALES Y METODOS 15

5.1. Reactivos 15

5.2. Modelo animal 15

5.3. Aislamiento y cultivo de fibroblastos cardíacos ventriculares de ratas neonatas 15

5.4. Desdiferenciación 16

5.5. Tinción con cristal violeta 16

5.6. Migración celular 16

5.7. Transducción adenoviral 17

5.8. Preparación de extractos celulares totales 17

5.9. Electroforesis en geles de poliacrilamida 18

5.10. Electrotransferencia de proteínas 18

5.11. Inmunowestern blot 18

5.12. Ensayo de unión de radioligando y desplazamiento por antagonistas específicos 19

5.13. Viabilidad celular 19

5.14. Fotografía de transmisión y epifluorescencia 20

5.15. Análisis estadístico 20

6. RESULTADOS 21

6.1. Expresión temporal de α-SMA inducida por TGF-1. 21

6.2. Viabilidad de MCN. 25

6.3. Ensayo de unión de radioligando ([125I]-Sar1-Ile8-Ang II) a los receptores de Ang II en FCN y MCN. 27

6.4. Efecto de Ang II sobre migración y viabilidad de FCN y MCN. 30

6.5. Sobre-expresión de los receptores de Ang II del subtipo AT1R y AT2R en FCN y MCN. 33

6.6. Ensayos de unión de radioligando ([125I]-Sar1-Ile8-Ang II) a los receptores de Ang II del subtipo AT1R y AT2R en MCN transducidos con AdATxR. 35

6.7. Viabilidad de FCN y MCN transducidos AdATxR y estimulados con Ang II. 39

6.8. Inhibición de la muerte del FCN-AdAT1R con losartán, PD 123319 e inhibidores de la vía activada por Ang II (PLC y PKC). 43

7. DISCUSIÓN 45

8. CONCLUSIONES 53

9. BIBLIOGRAFÍA 54

ÍNDICE DE FIGURAS



Figura 1. Expresión de la proteína –SMA inducida por TGF-1 en FCN. 22

Figura 2. Viabilidad de miofibroblastos cardiacos neonatos. 26

Figura 3. Ensayos de unión de radioligando ([125I]-Sar1-Ile8-Ang II) a los receptores de Ang II en FCN y MCN. 28

Figura 4. Efecto de Ang II sobre migración y viabilidad de FCN y MCN. 31

Figura 5. Sobre-expresión de los receptores de Ang II del subtipo AT1R y AT2R en FCN y MCN. 34

Figura 6. Ensayos de unión de radioligando ([125I]-Sar1-Ile8-Ang II) a los receptores de Ang II del subtipo AT1R y AT2R en MCN transducidos con AdATxR. 36

Figura 7. Viabilidad de FCN y MCN transducidos con AdAT1R y estimulados con Ang II. 40

Figura 8. Prevención de la muerte del FCN-AdAT1R incubados con antagonistas e inhibidores de la vía activada por Ang II. 44


ABREVIATURAS

-SMA : Alfa actina de músculo liso

AdAT1R : Adenovirus receptor AT1

AdAT2 R : Adenovirus receptor AT2

AdGFP : Adenovirus GFP

Ang II : Angiotensina II

APS : Persulfato de amonio

AT1R : Receptor de angiotensina II subtipo 1

AT2R : Receptor de angiotensina II subtipo 2

ATxR : Receptor de angiotensina II donde “x” puede ser 1 o 2

Bmáx : Número total de receptores expresado en pmoles/mg de proteína



BSA : Albúmina de suero de bovino

Ca+2 : Calcio

cAMP : Adenosina monofosfato cíclico

cél : Célula

cm : Centímetro

CMV : Citomegalovirus

cpm : Cuentas por minuto

csp : cantidad suficiente para

DMSO : Dimetil sulfóxido

EDTA : Acido etilendiaminotetraacético



EGTA : Ácido etilén glicol-bis(-aminoetil eter)-N,N,N’,N’-tetracético

FBS : Suero fetal de bovino

FCN : Fibroblastos cardiacos neonatos

FCN-AdAT1R : Fibroblasto cardiaco neonato transducido con AdAT1R

FCN-AdAT2R : Fibroblasto cardiaco neonato transducido con AdAT2R

FCN-AdGFP : Fibroblasto cardiaco neonato transducido con AdGFP

Fig : Figura

GFP : Proteína fluorescente verde

h : Hora


HA : Hemaglutinina

HEPES : Acido N-2-hidroxietilpiperazina N-2-etanosulfónico

JNK : Kinasa N-terminal de c-Jun

Kd : Constante de disociación

kDa : Kilo dalton

Los : Losartán

M199 : Medio 199

MAPK : Proteína quinasa activada por mitógenos

MCN : Miofibroblasto cardiaco neonato

MCN-AdAT1R : Miofibroblasto cardiaco neonato transducido con AdAT1R

MCN-AdAT2R : Miofibroblasto cardiaco neonato transducido con AdAT2R

MCN-AdGFP : Miofibroblasto cardiaco neonato transducido con AdGFP

MEC : Matriz extracelular

min : Minuto

mg : Miligramo

mL : Mililitro

mM : Milimolar

mm : Milímetro

MOI : Multiplicidad de infección

MTT : Bromuro de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio

NaCl : Cloruro de Sodio

NaOH : Hidróxido de sodio

Na3VO4 : Ortovanadato de sodio

nm : nanómetros

nM : nanomolar

nmoles : nanomoles

PBS : Tampón fosfato salino

PLC : Fosfolipasa C

pmoles : picomoles

PMSF : Fenilmetilsulfonifluoruro

PKC : Proteína kinasa C

p/v : Porcentaje peso volumen

rpm : Revoluciones por minuto



s : Segundos

SD : Desviación estándar

SDS : Dodecil sulfato de sodio

SDS-PAGE : Gel de poliacrilamida desnaturante

SEM : Error estándar de la media

TBS : Tampón tris salino

TCA : Acido tricloro acético

TGF- Factor de crecimiento transformante beta 1

TEMED : N,N,N´,N´-tetrametil-etilendiamina

Tris : Tris-(hidroximetil)-aminoetano

µg : Microgramo

µl : Microlitro

µM : Micromolar

µm : Micrómetro

vs : Versus

v/v : Porcentaje volumen volumen



WB : Western blot

RESUMEN
Fibroblastos y miofibroblastos cardiacos son elementos claves en el desarrollo del remodelamiento cardiaco después de un infarto agudo al miocardio. Una regulación controlada en el crecimiento de la población de fibroblastos y miofibroblastos es importante para una correcta cicatrización y mantención de la función cardiaca. Distintas evidencias muestran que los niveles de angiotensina II (Ang II) y del receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1R) aumentan después de un infarto agudo al miocardio. Por ésto, Ang II puede tener un papel central en la regulación del número y función de estas células post-infarto al miocardio. En esta memoria se realizaron ensayos de unión de radioligando, viabilidad y funcionalidad celular, en fibroblastos (FCN) y miofibroblastos cardiacos neonatos (MCN) con y sin expresión ectópica de AT1R o AT2R. Los ensayos de unión de radioligando mostraron que miofibroblastos y fibroblastos cardiacos neonatos expresaban solo AT1R. En ambas condiciones (con y sin expresión ectópica de AT1R o AT2R), los miofibroblastos mostraron mayor unión total de radioligando que los fibroblastos. Ang II (100 nM), estimuló la migración de los fibroblastos controles, y en los que expresaban ectópicamente AT1R disminuyó la viabilidad. Por otra parte, no se observaron efectos en miofibroblastos controles o que expresaban ectópicamente AT1R o AT2R. La muerte de los fibroblastos estimulados con Ang II se previno con losartán e inhibidores de fosfolipasa C (PLC) y proteína kinasa C (PKC), indicando la participación de estas vías de señales intracelulares. Los resultados obtenidos demuestran que Ang II actúa de manera selectiva sobre fibroblastos y miofibroblastos cardiacos neonatos, controlando la función celular en nuestro modelo de estudio.

SUMMARY


Cardiac fibroblasts and myofibroblasts are key elements of the development of cardiac remodeling after myocardial infarction. A tight regulation of fibroblast and myofibroblast growth is important to correct wound healing and maintain cardiac function. Several lines of evidence have showed an increase in angiotensin II and AT1R levels after myocardial infarction. Thus angiotensin II may play a pivotal role in the regulation of number and function of theses cells. Cell viability and function, and radioligand binding studies, were performed in neonate cardiac fibroblast and myofibroblast with/without ectopically expressed AT1R or AT2R. Radioligand binding studies demonstrated that neonate cardiac fibroblast and myofibroblasts expressed a single class of high affinity angiotensin II AT1R. In both conditions, myofibroblasts revealed a higher maximal binding capacity, compared to fibroblast. Angiotensin II (100 nM) increased the migration in normal fibroblast, and in ectopically expressed AT1R fibroblast reduced the cell viability. No effects were observed in normal or ectopically expressed AT1R or AT2R myofibroblast. Cardiac fibroblast cell death angiotensin II triggered was was prevented by losartan and by phospholipase C (PLC) and protein kinase C (PKC) inhibitors, indicating the participation of that intracellular signaling pathways. The data demonstrate that Angiotensin II acted in a selective manner on cardiac fibroblast and myofibroblast, controlling the cellular number and function.

1. INTRODUCIÓN
Actualmente, las enfermedades cardiovasculares dan cuenta del 27% de la mortalidad en los países desarrollados y se proyecta que para el año 2020, ellas serán la causa del 37% de los fallecimientos y del 60% de la morbilidad1. Por ello es de primera importancia conocer sus causalidades a un nivel molecular.

Desde el punto de vista celular, el corazón está compuesto principalmente por cardiomiocitos y células no musculares (entre ellas, fibroblastos, células de músculo liso vascular, células endoteliales, mastocitos, y células residentes del sistema inmune).

Los fibroblastos representan dos tercios de la población celular del corazón2. Inicialmente se pensó que los fibroblastos tenían una función meramente estructural. Sin embargo, hoy se sabe que son un elemento celular muy activo, pues pueden migrar, proliferar y desdiferenciarse a miofibroblastos3. Además, poseen una amplia variedad de receptores, secretan diversos factores de crecimiento y citoquinas, los que pueden actuar en forma autocrina y/o paracrina, y finalmente son blanco para una amplia variedad de estímulos tanto mecánicos como neuroendocrinos4. En condiciones normales, la principal función del fibroblasto es producir proteínas de la matriz extracelular (MEC), la que sustenta a los cardiomiocitos, mientras que en estados patológicos o de daño tisular participan activamente en el proceso de cicatrización2,5.

Un fibroblasto puede desdiferenciarse a miofibroblasto por medio de estímulos mecánicos y químicos al mismo tiempo. De éstos últimos, el factor de crecimiento transformante subtipo beta (TGF-, especialmente el TGF- 1), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento análogo a la insulina tipo II (IGF-II) y la interleuquina-4 (IL-4) son los más importantes. El miofibroblasto también posee una amplia variedad de receptores, además secreta diversos factores de crecimiento, citoquinas, quimioquinas, mediadores de inflamación y proteínas de la matriz extracelular, los que actúan en forma paracrina y autocrina, además son blanco para una amplia gama de estímulos químicos6. La principal característica estructural de este tipo celular es la presencia de microfilamentos citoplasmáticos formados por diferentes tipos de proteínas, siendo una de ellas la α-actina de músculo liso (-SMA). Esta proteína es uno de los principales marcadores del fenotipo del miofibroblasto. Sin embargo, también pueden expresar vimentina, desmina y miosina de cadena pesada de músculo liso3,6. La principal función del miofibroblasto es la reparación tisular (cicatrización) después de la injuria o daño tisular, siendo los principales elementos celulares presentes en el tejido de

granulación, y desaparecen cuando la cicatriz se completa a través de una masiva apoptosis3. Los miofibroblastos no son residentes normales del tejido cardiaco, ellos aparecen en el sitio del infarto, debido a la llegada de macrófagos activados que producen TGF-1 estimulando la des-diferenciación de fibroblasto a miofibroblasto, los que pueden persistir en este tejido por prolongados períodos de tiempo, donde generan señales fibrogénicas que perpetúan la reparación del tejido y promueven la fibrosis. Se desconoce porqué los miofibroblastos persisten en el infarto cardiaco después de largo tiempo, en comparación a los miofibroblastos de la piel, los cuales desaparecen por apoptosis una vez sanada la herida7.

A diferencia de los fibroblastos, los miofibroblastos poseen microfilamentos de actina asociados con proteínas contráctiles tales como miosina no muscular. Los microfilamentos se unen a la superficie del miofibroblasto hacia la MEC a través de adhesiones focales supermaduras (suFA), estructuras especializadas en la adhesión y caracterizadas por tener un tamaño de 8–30 m (comparado con las adhesiones focales presentes en fibroblastos de 2–6 m), que unen -SMA a través integrinas  o  con el fragmento ED-A fibronectina mediante un compleja composición proteica con altos niveles de vinculina, paxilina y tensina. Todos estos elementos conforman un mecanismo mecano-transductor especializado y característico8,9. Las suFA potencian la adhesión del miofibroblasto a las proteínas de la MEC, lo cual sumado a su aparato contráctil permite generar una considerable transmisión mecánica en su entorno extracelular10,11. Estas características del miofibroblastos son propias de un fenotipo celular de mayor adherencia a los diferentes sustratos de la MEC, y pueden ser muy importantes en los procesos que gatillan apoptosis (anoikis).

Hasta la fecha no hay estudios que muestren las diferencias entre fibroblastos y miofibroblastos del tejido cardiaco, y menos aún estudios relacionados con su respuesta a determinados estímulos hormonales o humorales. A este respecto, recientemente, Mayorga y cols.12 han mostrado que los fibroblastos de corazón son más resistentes a la apoptosis que sus similares de piel y pulmón. Por otro lado, en la piel los fibroblastos normales y los miofibroblastos de cicatrices hipertróficas, son más resistentes a la apoptosis que los miofibroblastos de cicatrices normales13.

Uno de los principales sistemas neurohumorales que regulan el tamaño de la población celular cardiaca es el sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), siendo la angiotensina II (Ang II) su principal efector. A nivel celular, Ang II regula la contracción, el crecimiento, apoptosis y diferenciación celular, la migración celular y el depósito de proteínas de la MEC. Además Ang II estimula la síntesis y secreción de otros factores de crecimiento, agentes vasoconstrictores y transactiva otros tipos de receptores de factores de crecimiento14,15. Ang II se une a dos tipos distintos de receptores acoplados a proteínas G, llamados receptor subtipo AT1 (AT1R) y subtipo AT2 (AT2R)16. Sin embargo, estos receptores se distinguen por su selectividad a distintos antagonistas no peptídicos, siendo losartán, entre otros, específico para AT1R y el PD 123319 específico para AT2R16. Del mismo modo, las vías de transducción activadas por cada receptor también son diferentes. La unión de Ang II a AT1R activa las fosfolipasas C, D, A2 e induce la apertura de canales de Ca+2, mientras que inhibe a la adenilato ciclasa14,17. Adicionalmente a estas vías clásicas, la activación de AT1R también estimula la fosforilación en tirosina de ciertas proteínas, que conduce a la activación de las ERK 1-2 y JNK. Contrariamente, la unión de Ang II al AT2R conduce a la defosforilación de ciertas proteínas regulatorias, por activación de fosfatasas, mecanismo que es importante en la diferenciación, apoptosis, y efectos antiproliferativos y vasodilatación18.

En el corazón la mayoría de las acciones de la Ang II son mediadas por AT1R. Este receptor se encuentra expresado en cardiomiocitos y fibroblastos19. Aunque, AT2R también se expresa en corazón, participa en el desarrollo fetal y desaparece prontamente después del nacimiento16. En el adulto, la mayoría de los receptores de Ang II son del subtipo AT1R, mientras que el subtipo AT2R es re-expresado después de un daño vascular y cardiaco y durante la cicatrización de las heridas20.

En el infarto cardiaco los niveles plasmáticos de angiotensinógeno y renina están aumentados. También en zonas de alto recambio de colágeno (como por ejemplo en zonas de infarto al miocardio), existe una alta densidad y actividad de ECA (enzima convertidora de angiotensina)7. Tomando en cuenta lo anterior, se puede deducir que en el sitio del infarto podría existir una sobreproducción de Ang II. Por estos antecedentes los AT1R y AT2R son de vital importancia en el proceso de reparación y remodelamiento cardiaco. El miofibroblasto expresa principalmente AT1R en la cicatriz del infarto, donde los niveles de mRNA y la expresión de proteínas del AT1R están incrementados21. La asociación anatómica de ECA y AT1R en la cicatriz del infarto acrecienta la perspectiva que una mayor concentración local de Ang II contribuye a la formación del tejido fibrótico. Campbell y Katwa mostraron que Ang II induce la expresión de TGF-1 (mRNA y proteína) en cultivos de miofibroblastos mediado primariamente por el AT1R, sugiriendo que Ang II estimula la formación de tejido fibrótico a través de la sobreproducción de TGF-1. Los AT2R se han ligado a la fibrosis, pero actualmente ésto sigue siendo confuso7.

Dado qué los AT1R son expresados en mayor número que los AT2R, los efectos de la estimulación de AT1R sobrepasan la actividad de AT2R, en el individuo adulto es difícil investigar el efecto de Ang II en el AT2R. Esto origina la posibilidad de que un AT2R no bloqueado, cuando es estimulado por un aumento de la Ang II circulante por causa de la injuria, puede contribuir a las acciones benéficas del bloqueo del AT1R. Por otro lado, se ha encontrado que bajo ciertas condiciones patológicas y específicamente en corazones humanos con cardiomiopatía dilatada los niveles de expresión de AT2R están aumentados siendo los fibroblastos el principal tipo celular donde se expresan esos receptores. La activación de dicho receptor se opone a las acciones mitogénicas de Ang II al estimular AT1R22. Finalmente, se ha encontrado también que el mRNA que codifica para AT1R y AT2R aumenta significantemente después de cuatro días de coartación aórtica, y solo los niveles proteicos de AT2R fueron aumentados23.

Aunque el número de receptores que expresan estas células en condiciones normales no es menor, resulta difícil estudiar su comportamiento frente a su ligando endógeno a concentraciones fisiológicas, en condiciones fisiopatológicas de elevada expresión, dado que se ha mostrado que el tiempo de cultivo y el número de pasajes celulares disminuye el número de receptores24,25. Para intentar asemejar las condiciones de las patologías antes descritas, se sobre-expresaron los dos subtipos de receptores con adenovirus específicos logrando una alta eficiencia de transducción.

De los antecedentes anteriormente expuestos surgen una serie de interrogantes a resolver:

a) ¿la desdiferenciación de fibroblasto a miofibroblasto cambia la densidad de AT1R y AT2R?,

b) ¿cuál es el efecto de Ang II sobre la viabilidad de fibroblastos o miofibroblastos que sobre expresan AT1R y AT2R?,

c) ¿cuáles son las vías transduccionales implicadas en estos procesos?

Para resolver estas interrogantes se ha desarrollado el siguiente estudio en el que se consideraron la desdiferenciación celular, estudios de unión de radioligandos y sobre-expresión de ambos subtipos de receptores.

2. HIPÓTESIS


Los fibroblastos y miofibroblastos cardíacos con sobre-expresión de AT1R o AT2R mueren en forma diferencial tras la estimulación por Ang II.

3. OBJETIVO GENERAL


Determinar la viabilidad de los fibroblastos y/o miofibroblastos cardiacos que sobre-expresan AT1R o AT2R por activación con Ang II.
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