Virus de las Hepatitis



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Virus de las Hepatitis
Hipócrates describió una epidemia de ictericia hace más de 2000 años. En la cuarta década de este siglo se comprobó la etiología viral de estas infecciones hepáticas (hepatitis viral). Desde entonces se han reconocido diferentes tipos de hepatitis virales. La Hepatitis viral es un conjunto de enfermedades clínicamente semejantes entre sí, pero de etiología y epidemiología diferentes e incluye: la Hepatitis viral tipo A, causada por el virus de la Hepatitis A (VHA), la Hepatitis viral tipo B, causada por el virus de la Hepatitis B (VHB), la Hepatitis viral tipo C, causada por el virus de la Hepatitis C (VHC), la Hepatitis viral tipo D, causada por el virus de la Hepatitis Delta (VHD) y la Hepatitis viral tipo E, causada por el virus de la Hepatitis E (VHE). Nuevos virus han sido reportados como agentes causales de Hepatitis, entre ellos están el virus de la Hepatitis G (VHG), el virus TT (VTT) y el virus SEN (SEN-V). Otros virus que, en su infección sistémica, pueden ocasionalmente estar implicados en la hepatitis incluyen al Citomegalovirus humano, el virus Epstein-Barr, el virus de la Rubeola, el virus de la Fiebre Amarilla, el virus del Herpes Simplex y algunos Enterovirus.

1. Agente etiológico. Propiedades físicas, químicas y biológicas. Replicación viral.

Las características de los virus de las hepatitis se resumen en la [Tabla 1].



I.1 Virus de la Hepatitis A.

El VHA fue primeramente observado en 1973 en las heces fecales de un paciente infectado, usando la Inmunomicroscopía electrónica. El VHA pertenece a la familia Picornaviridae, género Hepatovirus. Posee un tamaño pequeño (27 a 32 nm), densidad en CsCl de 1.32 a 1.34 g/cm3, simetría icosaédrica y no poseen envoltura [Figura 1]. Presenta tres proteínas de la cápside, la VP1 con un peso molecular de 30 a 33 kDa, la VP2 de 24 a 29 kDa y la VP3 de 21 a 27 kDa. El genoma viral consiste en un ARN lineal, de simple cadena y de aproximadamente 7.5 kb, posee un tallo poly(A) en el extremo 3' y una proteína viral (Vpg) en el extremo 5'. En el extremo 5' una región no codificante precede a un largo marco abierto de lectura (MAL) seguido por una pequeña región no codificante en el extremo 3'. El MAL codifica para una poliproteína de 2227 aminoácidos, la cual se organiza en tres regiones, P1, P2 y P3. La región P1 codifica para cuatro proteínas de la cápside viral VP1, VP2, VP3 y VP4. La región P2 codifica para las proteínas 2A, 2B y 2C, la región P3 codifica para las proteínas 3A, 3B, 3C y 3D. Estas dos últimas regiones genómicas codifican para las proteínas no estructurales.

El VHA es resistente al ácido, al éter y al cloroformo. Son relativamente resistentes al calor (600C durante 1 hora), aunque se inactiva parcialmente después de 10 a 12 horas a 60 0C. Su infectividad se destruye después de calentarse a 850C por menos de 1 segundo. El virus se destruye en autoclave (121 0C durante 20 minutos), por ebullición en agua durante 5 minutos, por calor seco (180 0C durante 1 hora), por radiaciones ultravioletas (un minuto a 1.1 Watts), por tratamiento con formalina (1:2000 durante tres días a 37 0C), y por tratamiento por cloro (10 a 15 ppm durante 30 minutos). El virus puede preservarse por años a <200C y por lo menos 1 mes en estado desecado a 25 0C.

Solo se conoce un serotipo del VHA. No se ha reportado reactividad antigénica cruzada con otros virus causantes de hepatitis ni con otros virus de la familia Picornaviridae.

Las cepas aisladas de hepatitis A han sido agrupadas en 7 genotipos (I a VII), incluyendo cuatro de origen humano (I, II, III y IV) y tres de origen animal (simios), que no son transmisibles al humano.

El VHA puede provocar infección en algunos primates, como el chimpancé, los monos lechuza (Aoutus trivirgatus) y en muchas especies de monos tities de América del Sur (Saguinus mystax y S.labiatus).

El VHA es difícil de aislar y propagar "in vitro". El aislamiento a partir de especimenes clínicos requiere de muchas semanas y pases ciegos. Varios tipos de cultivos celulares, ya sean primarios o líneas continuas originadas de primates, soportan el crecimiento del virus. Los mas usados son el cultivo primario de células de riñón de mono verde africano (AGMK), de fibroblastos humanos y de líneas de células diploides de pulmón humano (MRC-5). Las líneas derivadas de AGMK (BSC-1, Vero, BGMK), células de riñón de mono Rhesus fetal (FRhK4, FRhK6, Frp/3) y de hepatomas humanos (PLC/PRF/5) son útiles para los estudios de replicación y de propagación.

Replicación viral

El evento inicial del proceso de replicación del VHA es la unión del virus a su receptor, conocido como a-2-macroglobulina, localizado en la membrana plasmática de la célula hospedera; este evento requiere de la presencia de Ca2+. Posteriormente se produce la liberación del genoma viral en el citoplasma de la célula por un mecanismo no bien conocido, pero que involucra la pérdida de la proteína VP4 y la separación del ARN de la cápsida, proceso conocido como descapsidación.

La fase de eclipse es incompleta, probablemente debido a una replicación asincrónica. A continuación comienza la replicación viral. Una vez liberado el ARN de sentido positivo, este es amplificado a través de un intermediario de cadena negativa. El proceso de replicación se lleva a cabo en dos fases: la primera involucra la copia de la cadena de ARN positiva en una cadena negativa y la segunda utiliza esta cadena negativa para la síntesis posterior de ARN de cadena positiva. El ARN mensajero viral debe ser traducido de forma independiente, lo cual sucede por intermedio de un mecanismo interno de unión al ribosoma, que involucra la subunidad de 40S de este organelo. Las proteínas comienzan a aparecer en la célula infectada de acuerdo con su ubicación 5'-3' en el genoma y se produce como una gran poliproteína. Esta es procesada proteolíticamente, mientras se sigue formando, para originar un precursor de P1, P2 y P3. Esta ultima (P3) se autoprocesa para originar tres pequeñas proteínas que son: una proteinasa (3C), requerida para el procesamiento posterior del resto de las proteínas virales; la proteína 3AB, que origina la Vpg necesaria para el inicio de la síntesis del ARN viral y la polimerasa de ARN (3D).

Finalmente, con el incremento de la concentración de proteínas y la de ARN+, estas moléculas son empaquetadas en el virión, conjuntamente con el proceso de ensamblaje de las subunidades proteícas. De esta forma queda conformada la progenie viral. La formación de la partícula infectiva tiene lugar por un proceso de maduración, en el cual la mayoría de la VPO es transformada a la forma madura de cuatro subunidades formadas por VP4, VP2, VP3 y VP1, lo cual es característico de todos los miembros de la familia Picornaviridae.



I.2 Virus de la hepatitis B.

El VHB pertenece a la familia Hepadnaviridae, género Orthohepadnavirus. La microscopía electrónica de un suero reactivo al antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) revela tres formas morfológicas. Las partículas en mayor número son esféricas, miden 22 nm de diámetro y están formadas de manera exclusiva por HBsAg; las formas tubulares o filamentosas tienen el mismo diámetro pero pueden tener más de 200 nm de longitud generada por la sobreproducción del HBsAg. Los más grandes son las llamadas partículas Dane, son viriones esféricos de 42 nm y se observan con menor frecuencia. La superficie más externa de la partícula Dane contiene HBsAg y rodea a un centro interno de la nucleocápside de 27 nm que contiene el antígeno del core (HBcAg) [Figura 2].

El genoma viral consiste en ADN circular parcialmente bicatenario con 3,2 kb de longitud. Una cadena denominada "menos" es un círculo casi completo y contiene genes superpuestos que codifican tanto proteínas estructurales (pre-S, superficie, core) como proteínas replicativas (polimerasa, X). La otra cadena "mas" es corta y de longitud variable. Existen cuatro MAL que codifican para las proteínas estructurales de la superficie (S) y del centro del virión (C), un pequeño transactivador transcripcional (X), y una proteína polimerasa grande (P) que incluye actividades de DNA polimerasa, transcriptasa inversa y RNAsa. El gen S tiene tres codones de inicio dentro del marco y codifica las proteínas de la envoltura, que están constituidas por tres polipéptidos: la proteína pequeña (S) que esta compuesta por 226 aminoácidos, la proteína media (M) que incluye la secuencia completa de la proteína S mas la región preS2 y la proteína grande (L) que incluye las regiones S, preS2 y preS1. El gen C tiene dos codones de inicio dentro del marco y codifica el HBcAg además de la proteína HBe que es procesada para producir antígeno e (HBeAg) soluble.

Las partículas de HBsAg son antigénicamente complejas; originalmente fueron clasificadas en cuatro subtipos adw, ayw, adr y ayr basada en la presencia de un determinante grupo-específico "a" y los determinantes específicos de subtipo d ó y y w ó r. Después del descubrimiento de subtipos adicionales, la clasificación del HBsAg fue expandido para incluir nueve subtipos llamados: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+ y adrq-.

La estabilidad del HBsAg no siempre coincide con la del agente infectante. Sin embargo, ambos son estables a <20 0C durante mas de 20 años y estables a la congelación y la descongelación repetidos. El virus es estable a 37 0C durante 60 minutos y permanece viable al menos una semana después de secado y almacenado a 25 0C. El VHB es sensible a temperaturas mas altas (100 0C durante un minuto) o a períodos de incubación mas prolongados (60 0C durante 10 horas) según la cantidad de virus presente en la muestra. El HBsAg es estable a pH de 2.4 por más de seis horas, pero se pierde la infectividad del VHB. El hipoclorito de sodio al 0.5% destruye la antigenicidad en tres minutos con concentraciones escasas de proteína, pero las muestras de suero no diluido requieren concentraciones mayores (5%). El VHB es inactivado por el alcohol etílico al 80 % a 11 0C por 2 minutos. El HBsAg no se destruye con la radiación ultravioleta del plasma o de otros productos sanguíneos, y la infectividad viral también puede resistir este tratamiento.

Replicación viral

El proceso de replicación de los hepadnavirus tiene cuatro características: en primer lugar se convierte el ADN asimétrico en ADN circular covalentemente cerrado (ADNccc). En segundo lugar, se realiza la transcripción del ADNccc para generar un intermediario de ARN (pregenoma viral). En tercer lugar, se produce la síntesis de la cadena de ADN "menos", por transcripción inversa del pregenoma, y por último se sintetiza la cadena "mas" utilizando como molde la cadena "menos".

El VHB se une a la superficie celular y penetra en la célula. Se cree que el core viral es transportado al núcleo de la célula sin ser procesado. El ADN viral circular asimétrico se convierte seguidamente en un ADNccc que parece actuar como molde para la síntesis del ARN viral. La integración del ADN del VHB en el genoma del huésped no se produce en el curso de la replicación normal, a diferencia de lo que ocurre con los retrovirus. La transcripción produce ARN de diversos tamaños, el mas pequeño es de 0.7 kb y codifica la proteína X, otro de 2.1 kb codifica las proteínas principal y media de la envoltura viral, el de 2.4 kb codifica la pre-S1, la pre-S2 y el HBsAg y el mas largo de 3.5 kb sirve de molde para la replicación del genoma y para la expresión de las proteínas pre/core y polimerasa. La síntesis de la cadena de ADN "menos" se inicia en el 3' DR1 (repeticiones directas cortas), con la proteína terminal de la polimerasa como cebador y, a medida que progresa la síntesis, el molde de ARN es degradado simultáneamente por la ARNasaH (enzima que degrada el molde de ARN para la replicación). La síntesis de la cadena "mas" del ADN se inicia en el extremo 3' del DR2 y continua hasta pasar la proteína terminal del extremo 5' de la cadena "menos". Esto produce una molécula de ADN circular abierta similar a la del VHB maduro. Dado que la mayoría de las partículas de VHB contienen círculos de ADN abiertos con cadenas "mas" incompletas, se ha planteado la posibilidad de que la polimerasa del virus este limitada de alguna forma en este punto. Las partículas core maduras son empaquetadas entonces para formar el HBsAg/pre-S en el retículo endoplásmico y así son expulsadas de la célula. Se mantiene una cantidad estable de ADNccc en los núcleos mediante el transporte del ADN del VHB recién sintetizado de nuevo hacia el núcleo. Dado que el HBsAg puede inhibir la formación del ADNccc, esto puede constituir una retroacción negativa para la replicación del VHB.

I.3 Virus de la hepatitis C.

Las evidencias clínicas y epidemiológicas, unido a los experimentos de inducción cruzada en chimpancés habían sugerido que existían varios agentes de la hepatitis no-A no-B (NANB) los cuales serológicamente no se vinculaban con el VHA o el VHB. No fue hasta 1989 que se logro la identificación del agente causal. El descubrimiento de una secuencia nucleotídica y su caracterización utilizando las técnicas de ingeniería genética, obviando los principios clásicos de la virología, permitieron establecer la etiología de la hepatitis NANB de transmisión parenteral, al que fue llamado virus de la hepatitis C.

El VHC pertenece a la familia Flaviviridae, y posee similitud con los virus que conforman el género Flavivirus o Pestivirus, recientemente se ha propuesto un género independiente para este agente, el cual tentativamente se ha llamado Hepacivirus. El virus posee un tamaño de 30 a 72 nm rodeado de una envoltura de glicoproteínas con espículas en su superficie.

Es un virus ARN de simple cadena, sentido positivo, con un genoma de 9.4 kb, el cual posee un único MAL que codifica para una gran poliproteína. El genoma consiste en una región 5' no codificante, un core (C), la envoltura (E o E1), una región que codifica para las proteínas no estructurales (NS) y una región 3' no codificante. La región NS consiste en 5 partes, NS1, NS2, NS3, NS4, y NS5. La región NS1, aunque llamada NS, se piensa que codifica parte de la envoltura, porque la región E o E1 es muy pequeña para codificar la proteína de la envoltura entera y porque hay muchos sitios de N-glicosilación en esta región. Por tanto, NS1 es además llamada E2. Otras regiones NS se piensa que codifican para proteasas dependientes de serina, ATPasa-helicasa (NS3) y ARN polimerasa ARN dependiente. (NS5). Estas proteínas virales pueden ser producidas por el clivaje de la poliproteína por proteasas virales y celulares [Figura 3].

A falta de un sistema de cultivo celular para investigar diferencias en la neutralización y las propiedades citopáticas del VHC, las comparaciones entre las secuencias nucleotídicas y los ensayos de tipaje, se han convertido en las técnicas principales para caracterizar las diferentes variantes del VHC. La comparación de secuencias ha dado información acerca del virus a varios niveles. La identificación y la clasificación del VHC en diferentes genotipos han mostrado variedad en la distribución geográfica y en la epidemiología. En particular, la secuencia aminoacídica inferida de las glicoproteínas de la envoltura difiere considerablemente, y es probable que los anticuerpos elevados en respuesta a la infección con un genotipo falle para neutralizar otros. Esta variación ha sido uno de los problemas a enfrentar en el desarrollo de vacunas.

La infectividad del VHC se destruye por extracción con cloroformo y mediante el calentamiento a 60 0C durante 30 minutos.



Heterogeneidad genómica del VHC.

El VHC posee una alta frecuencia de mutaciones, que es típica de los virus con genoma de ARN, las cuales no se distribuyen uniformemente a lo largo del mismo. La homología de la secuencia nucleotídica entre diferentes tipos y entre varios aislamientos del mismo tipo vario en diferentes regiones del genoma del VHC. La región 5' no codificante es altamente conservada (93-99 %). La región del core es bastante constante, estimándose la homología entre diferentes tipos en un 81 - 96 % a nivel nucleotídico y 90 - 98 % a nivel aminoacídico.

Algunas regiones del genoma muestran muy baja homología, por ejemplo, la región que codifica para la envoltura E y NS1/E2 y la región NS2. La región terminal 3' no codificante es también muy variable.

La secuencia aminoacídica de las regiones de la envoltura (E y NS1/E2) demostró una alta variabilidad, reportándose dos subregiones hipervariables (RHV 1 y 2) dentro de la misma.

La variabilidad genómica del VHC ha llevado a su clasificación en genotipos, basada en la amplificación selectiva de regiones especificas del core y de la región NS5, esta última clasificación es de las mas extendidas y útiles, por las ventajas prácticas que aporta y consiste en la división de los aislamientos en seis genotipos (del 1 al 6), algunos de ellos subdivididos en subtipos (1a, 1b y 1c).

Se desconocen muchos aspectos clínicos, epidemiológicos y terapéuticos relacionados con la variabilidad genómica del VHC, se ha estimado que posibles diferencias en el curso de la enfermedad asociado con diferentes genotipos, como la tasa de desarrollo de cirrosis, el carcinoma hepatocelular y la respuesta al tratamiento con interferón. Desde el punto de vista virológico, es imposible predecir como el grado de diferencia en la secuencia entre genotipos pudiera influir en el comportamiento del virus.


I.4 Virus de la hepatitis D.

El VHD humano es único dentro del mundo animal. Se parece a los pequeños patógenos ARN de plantas llamados viroides. El VHD es un virus defectivo que necesita de la ayuda de un virus auxiliar, en este caso del VHB para su replicación y transmisión. En la sangre, la partícula infecciosa contiene antígeno delta (AgHD) rodeado por una envoltura de HBsAg. El tamaño del VHD es de 35 a 37 nm y posee una densidad de flotación de 1.24 a 1.25 g/mL. El genoma del VHD consiste en un ARN de 1.7 kb, circular, de simple cadena, que posee un alto grado de apareamiento interno y codifica para el AgHD; el mismo no presenta homología con el genoma del VHB, pero se plantea que si puede inhibir la replicación del mismo. Este virus con frecuencia se vincula con las variantes mas graves de hepatitis en los pacientes positivos al HBsAg.

El AgHD se ha sometido a tratamiento químico y enzimático. No pierde su actividad después de tratamientos con ácido etilendiaminotetraacético, detergentes, éter, nucleasas, glucosidasas, o ácido; pero se detecto perdida parcial o completa de la actividad después de los tratamientos con álcali, tiocianato, clorhidrato de guanidina, ácido tricloroacético y enzimas proteolíticas.

El VHD se ha estudiado en modelos de animales, siendo los mas usados el chimpancé y la marmota americana (Marmotta monax).



Replicación viral

En el hepatocito infectado, el ARN del VHD esta presente bajo su forma genómica y antigenómica, en una proporción de 5 - 30 (genómica) a 1 (antigenómica). El VHB y el VHD aunque poseen la misma envoltura, utilizan diferentes receptores para infectar al hepatocito. El mecanismo de replicación del VHD es en "círculo rodante", es decir, para cada cadena genómica y antigenómica, las cadenas multiméricas son autoclivadas en cadenas monoméricas, las cuales forman un círculo y son copiadas para dar lugar a una cadena multimérica complementaria. La cadena circular genómica es envuelta por HBsAg para formar las partículas infecciosas.



I.5 Virus de la hepatitis E.

Otro virus originalmente clasificado como un agente NANB de transmisión entérica, en 1989 se identificó como el VHE. Este tipo de hepatitis fue primeramente reportado en Nueva Delhi, India en 1955, donde se identificaron 29 000 casos de hepatitis ictérica debido a la contaminación fecal del agua potable de la ciudad. Pertenece a la familia Caliciviridae, es un virus pequeño, esférico, no envuelto, de un diámetro de 27 a 34 nm, su densidad en CsCl es de 1.35 g/cm3 y por Inmunomicroscopía electrónica se ha observado que posee indentaciones en la superficie del virión. El genoma consiste en un ARN de cadena única, sentido positivo y de 7.5 kb de tamaño, el cual esta flanqueado por pequeñas secuencias no codificantes en los extremos 5' y 3'. Posee 3 MAL, el mayor (MAL1) esta localizado en el extremo 5' y codifica elementos no estructurales con actividad enzimática, el MAL2 situado en el extremo 3' controla la síntesis de las proteínas estructurales y el MAL3 es el mas pequeño, se encuentra en una posición intermedia y expresa una proteína de función desconocida.

El VHE existe como un serotipo único, es decir, aislamientos del VHE de diferentes regiones geográficas comparten el mismo patrón antigénico y en las pruebas serológicas usuales reaccionan igual los sueros de personas convalecientes independientemente de su origen geográfico. Comparaciones en la secuencia nucleotídica revelaron que globalmente las cepas de VHE, parecen caer dentro de tres grupos genéticos: sudeste asiático (cepa Birmana y algunas cepas Indias), Asia Central y del Norte (cepas de China, Pakistán, Kirguizia y unas pocas de la India) y norteamericana (México). Con estos datos se ha planteado que la heterogeneidad genética esta distribuida regionalmente, lo que sugiere que el VHE es un virus viejo, dispersado geográficamente en el pasado distante.

Como modelos animales se han usado los primates no humanos (macacos Cynomolgus, monos Rhesus, marmosets, tamarins, chimpancés, etc). Vertebrados no primates como cerdos domésticos jóvenes, corderos y ratas de laboratorio han sido susceptibles a la infección por el VHE. Desde el punto de vista epidemiológico, es notable señalar que anticuerpos anti-VHE se han encontrado en roedores salvajes que habitaban cerca de fuentes de agua potable, en un área rural endémica al VHE. Estos hallazgos implican la relación entre animales domésticos y quizás algunos salvajes en la perpetuación del virus, la interrogante de sí la enfermedad es o no una zoonosis queda por investigar.

El VHE no crece bien en cultivos celulares convencionales, sin embargo, bajo ciertas condiciones experimentales parece ser capaz de propagarse en células cultivadas, por ejemplo, el co-cultivo primario de células de hígado y riñón procedentes de monos infectados con células de línea (FRhK4 y 4647). Investigadores chinos han logrado aislar una cepa de VHE en células 2BS y A549, esta última exhibió un efecto citopático marcado.

El VHE es estable en condiciones ambientales, por el contrario es lábil en condiciones de laboratorio y pierde su integridad después de procedimientos de rutina como la congelación y la descongelación, la sedimentación en soluciones salinas y la diálisis. Estos rasgos son inusuales para un agente el cual, bajo condiciones naturales, sobrevive en el ambiente a pesar de la exposición a condiciones desfavorables como la temperatura elevada, la radiación solar y los extremos osmóticos.



Replicación viral

En ausencias de sistemas de cultivo "in vitro", no se comprenden bien las estrategias de expresión y replicación del VHE. El mecanismo de unión, entrada y denudamiento del VHE no es conocido, pero se asume que el virus se une a sitios receptores sobre los hepatocitos y, posiblemente, células del intestino. Se ha propuesto la siguiente estrategia: los productos de los genes que codifican proteínas no estructurales son expresados presumiblemente por el genoma de sentido positivo en toda su longitud después de entrar en la célula. El primer paso es la generación de ambas cadenas negativas de ARN (cadenas antigenómicas). El ARN antigenómico puede conducir a la producción de ARN genómico adicional de longitud completa y a expresión de proteína no estructural, además para la producción de mensajes subgenómicos más pequeños. Esto inicia la segunda fase de la replicación viral, que es la producción de proteínas virales estructurales. La encapsidación de ARN genómico ocurre por la asociación con la proteína de la cápside.


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